【獸藥名稱】
通用名稱：非洲豬瘟快速診斷試劑盒
商品名稱：無
漢語拼音：Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Kuaisu Jiance Shijihe
英文名稱：Real-time PCR for Rapid Detection of African Swine Fever Virus
非洲豬瘟快速診斷試劑盒【主要成分與含量】
序號 | 成分 | 含量 |
1 | PCR反應(yīng)液 | 1管（1ml/管） |
2 | Solution A | 1管（5.5ml/管） |
3 | Solution B | 1管（5.5ml/管） |
4 | 陰性對照 | 1管（0.5ml/管） |
5 | 陽性對照 | 1管（0.25ml/管） |
6 | 說明書 | 1份 |
【作用與用途】本試劑盒適用于豬血液、豬肉組織、淋巴結(jié)、脾臟等樣本中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。
【用法與判定】
1 用法
1.1 樣品處理及模板準(zhǔn)備
1.1.1 樣品處理
·組織樣品處理：分別從豬肉組織、淋巴結(jié)、脾臟不同位置取樣，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.1g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml無菌離心管，12000 r/min離心2分鐘，取上清200μl備用。
·血液樣品無需處理，取200μl備用。
1.1.2 模板準(zhǔn)備
·根據(jù)不同的樣本類型，按照下表準(zhǔn)備相應(yīng)的樣本用量。
·將樣本加入到1.5 ml離心管中，加入下表體積的Solution A，渦旋震蕩20 s，并按照下表的處理方法，室溫靜置3-5 min，或95℃金屬浴振蕩孵育3-5 min。
·樣本充分裂解后(95℃金屬浴振蕩孵育的樣本需恢復(fù)室溫)，加入下表體積的Solution B，并渦旋震蕩30 s，12000rpm離心2min，上清即為模板DNA。
·處理后的樣本如在2小時內(nèi)進行下一步試驗，請于4℃保存，如不能立即進行下一步試驗，請于-20℃保存。
樣本類型 | 樣本用量 | Solution A | 處理溫度及時間 | Solution B |
全血 | 10 μl | 100 μl | 室溫靜置3-5min | 100 μl |
唾液 | 100ul | 100ul | 室溫靜置3-5min | 100 μl |
口腔拭子 | 1個 | 400 μl | 95℃，3-5min | 400 μl |
組織勻漿 | 10 μl | 100 μl | 室溫靜置3-5min | 100 μl |
備注：組織樣本加入10倍體積的生理鹽水制成組織勻漿液后，可按照血液樣本的處理方法進行處理。
1.1.3可利用商品化試劑盒提取核酸進行反應(yīng)，效果更佳
1.2 熒光PCR擴增
1.2.1 試劑準(zhǔn)備
實驗前20分鐘將試劑從冰箱取出并恢復(fù)至室溫，使其*融化，充分混勻后瞬時離心去除管壁吸附液體。
1.2.2 配制反應(yīng)體系
按下表1體系，在配套PCR管中配制反應(yīng)體系，蓋緊管蓋后瞬時離心10秒，轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)。
表1 PCR反應(yīng)體系
成分 | 體積 |
PCR反應(yīng)液 | 18μl |
預(yù)準(zhǔn)備的模板（樣本/對照） | 2μl |
總體積 | 20μl |
1.2.3 PCR擴增
快速模式
表2 儀器PCR擴增參數(shù)
階段 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
1 | 95℃ | 30s | 1 |
2 | 95℃ | 10 s | 40 |
60℃ | 20 s（采集熒光信號） | ||
FAM通道采集熒光信號，需要內(nèi)參的話請同時打開HEX/VIC熒光通道 | |||
2 判定
2.1 合理調(diào)整閾值線，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進行調(diào)整。
2.2 試劑盒有效性判定
·陰性對照：無Ct值，線形為直線或微斜，無明顯指數(shù)增長。
·陽性對照：Ct值≤30，有明顯指數(shù)增長，呈典型的S型曲線。
2.3 樣本結(jié)果判定
·樣本檢測結(jié)果Ct值≤38，有明顯指數(shù)增長，判定為陽性，表明樣本中檢測出非洲豬瘟病毒。
·樣本檢測結(jié)果38
·樣本檢測結(jié)果無Ct值，判定為陰性，表明樣本中未檢測出非洲豬瘟病毒。
【注意事項】
(1)實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按步驟執(zhí)行，不使用本試劑盒提供的組份或不按照說明書進行實驗可能導(dǎo)致錯誤結(jié)果。
(2)所有試劑應(yīng)在規(guī)定溫度儲存。-20℃保存的試劑在使用前應(yīng)充分混勻。試劑盒反復(fù)凍融次數(shù)不宜超過5次。
(3)實驗操作應(yīng)按照國家有關(guān)臨床基因擴增實驗室管理規(guī)范執(zhí)行，實驗過程應(yīng)分區(qū)(試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴增區(qū))，各區(qū)物品為，不得交叉使用，避免污染。
(4)操作臺、移液器、離心機等儀器用品應(yīng)經(jīng)常用1%次氯酸鈉、75%乙醇或紫外燈進行消毒。耗材應(yīng)進行無酶處理。
(5)待檢樣本、試劑盒組份及實驗中的廢棄物需按照具有潛在傳染性物質(zhì)處理方法進行處理。
(6)為防止熒光干擾，應(yīng)避免使用含熒光物質(zhì)的手套，避免用手直接接觸，預(yù)防交叉污染。
(7)檢測結(jié)果為陰性，并不*代表為非感染狀態(tài)，具體診斷需結(jié)合獸醫(yī)臨床。
(8)產(chǎn)生假陰性的可能原因為：待檢樣本在采集、運輸、保存及核酸提取過程中操作不當(dāng)造成DNA降解;樣本中核酸濃度低于低檢測限;病毒待測靶基因出現(xiàn)變異;未經(jīng)驗證的其他干擾因素。
(9)產(chǎn)生假陽性的可能原因為：待檢樣本采集、運輸及核酸提取過程中發(fā)生交叉污染。
【規(guī)格】 50反應(yīng)/盒
【貯藏及有效期】 試劑盒-20℃以下冷凍避光保存，有效期為12個月。
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