Nature長(zhǎng)文：構(gòu)建人源化的小鼠模型

本文轉(zhuǎn)載自“生命奧秘”。

1915年，處于戰(zhàn)爭(zhēng)狀態(tài)，日本病理學(xué)家Katsusaburo Yamagiwa和他的助理Koichi Ichikawa正在努力研究一個(gè)致命武器，其殺傷力堪比西線戰(zhàn)場(chǎng)的戰(zhàn)爭(zhēng)。這個(gè)來(lái)自東京大學(xué)（Imperial University）的二人組花了150多天把煤焦油涂在兔子的耳朵上。zui后，他們發(fā)現(xiàn)兔子罹患了腫瘤。

Yamagiwa的兔子模型被認(rèn)為是*個(gè)用于癌癥研究的動(dòng)物模型。自此，科學(xué)家使用了包括細(xì)胞系、基因工程小鼠在內(nèi)的多個(gè)模型來(lái)模擬人類癌癥。但為解答特定實(shí)驗(yàn)問(wèn)題而選擇模型時(shí)需要考慮多個(gè)因素。

據(jù)馬薩諸塞州波士頓丹娜法伯癌癥研究院（Dana-Farber Cancer Institute）的醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)家David Weinstock表示，什么樣的模型是一個(gè)好的癌癥模型“是一個(gè)非常復(fù)雜的問(wèn)題，zui簡(jiǎn)單的答案是它必須能夠給我啟發(fā)——真正回答我想問(wèn)的問(wèn)題。如果不能，那就是在浪費(fèi)我的時(shí)間”。

對(duì)于美國(guó)癌癥研究所（US National Cancer Institute, NCI）的部門負(fù)責(zé)人Nancy Boudreau來(lái)說(shuō)，模型與人類癌癥的相似度至關(guān)重要。她表示，模型越能體現(xiàn)人類疾病的發(fā)生和發(fā)展就越好。理想的癌癥模型應(yīng)該能夠反映人類癌癥發(fā)生的許多特征，包括如何應(yīng)對(duì)免疫系統(tǒng)、如何轉(zhuǎn)移，或從其主要來(lái)源擴(kuò)散到身體的其它部位，以及如何對(duì)治療產(chǎn)生響應(yīng)。這需要科學(xué)家了解每種癌癥模型的優(yōu)缺點(diǎn)，因?yàn)闆](méi)有哪個(gè)模型能夠解答所有問(wèn)題。

一些證據(jù)表明，盡管有很多選擇，但現(xiàn)有的癌癥模型還不足以開(kāi)發(fā)療法。生物技術(shù)創(chuàng)新組織（Biotechnology Innovation Organization）審查了從2006年至2015年的臨床試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在針對(duì)15種疾病組別的臨床試驗(yàn)中，癌癥藥物的失敗率zui高，在通過(guò)臨床1期的癌癥藥物中，zui終獲得批準(zhǔn)的比例僅為5.1%。相比之下，血液學(xué)和傳染病藥物的臨床試驗(yàn)成功率分別為26.1％和19.1％。

德國(guó)癌癥研究中心（German Cancer Research Center）的血管腫瘤專家Hellmut Augustin指出，如果更好的臨床前模型可以將臨床轉(zhuǎn)化率提高10％，這將*地提高臨床前癌癥研究的質(zhì)量，并為藥物節(jié)省巨大開(kāi)支。

研究人員一直為改進(jìn)現(xiàn)有模型做出了諸多努力。他們?cè)诜秶鷥?nèi)展開(kāi)合作，希望改善這些模型。例如，NCI、英國(guó)癌癥研究所（Cancer Research UK）、英國(guó)維康信托桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）和荷蘭烏得勒支的非營(yíng)利性組織Hubrecht Organoid技術(shù)公司聯(lián)手開(kāi)展了一項(xiàng)名為人類癌癥模型倡議（Human Cancer Models Initiative）的計(jì)劃。該倡議于2016年啟動(dòng)，目標(biāo)是在細(xì)胞系中開(kāi)發(fā)1000種新型癌癥模型，以供研究人員使用。這些項(xiàng)目表明，許多科學(xué)家都認(rèn)同擴(kuò)大癌癥模型庫(kù)的價(jià)值。

修飾小鼠基因組

一般情況下，細(xì)胞株都可以幫助我們解決很多研究難題。但這些細(xì)胞通常以2D形式生長(zhǎng)，缺乏人類癌癥生長(zhǎng)，尤其是免疫系統(tǒng)生長(zhǎng)的正常條件。這使培養(yǎng)的細(xì)胞不適合模擬癌癥的多個(gè)特征。NCI的癌癥系統(tǒng)生物學(xué)家Shannon Hughes指出，相比之下，基因工程小鼠（genetically engineered mouse, GEM）適用于多個(gè)研究。它們能更好地模擬人類癌癥特征，并且容易操控。

多年來(lái)，基因工程小鼠需要復(fù)雜的過(guò)程來(lái)產(chǎn)生所需的DNA，在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將其注入到小鼠胚胎，以修飾小鼠的基因。但是，與大多數(shù)其它遺傳修飾應(yīng)用一樣，現(xiàn)在制作GEM的方法隨著CRISPR基因編輯系統(tǒng)的問(wèn)世而獲得改進(jìn)。紐約威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院（Weill Cornell Medical College）的癌癥生物學(xué)家Lukas Dow表示，CRISPR可以完成一些非常精細(xì)的、以前無(wú)法完成的操作。例如現(xiàn)在誘導(dǎo)大型染色體重組，如反轉(zhuǎn)、缺失和易位的技術(shù)已經(jīng)比較簡(jiǎn)單直接了。但有了CRISPR后，科學(xué)家甚至可以改變嚙齒動(dòng)物的DNA中的一個(gè)堿基。他指出，這種技術(shù)還可以清晰到讓每個(gè)堿基的分辨率準(zhǔn)確再現(xiàn)科學(xué)家在人類癌癥中觀察到的突變。以前的癌癥模型都忽略了這些細(xì)節(jié)，但是病因往往就在這些細(xì)節(jié)里。

韓國(guó)基礎(chǔ)科學(xué)研究所（South Korea’s Institute for Basic Science）的基因組工程師Taeyoung Koo等人使用CRISPR靶向一個(gè)非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）突變。他們報(bào)告指出，15％的人類NSCLC病例涉及表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth-factor receptor, EGFR）基因中僅一個(gè)DNA堿基的改變（即單核苷酸突變）。目前治療方案主要是使用靶向該基因的突變蛋白的藥物，例如gefitinib。

Koo的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了CRISPR-Cas9向?qū)NA序列，該序列識(shí)別zui常見(jiàn)的EGFR突變區(qū)域（這種突變占EGFR突變相關(guān)NSCLC病例的40％以上）。然后他們將人類NSCLC腫瘤植入小鼠，并用CRISPR-Cas9和特定的向?qū)NA靶向突變。結(jié)果顯示，設(shè)計(jì)合理的向?qū)NA能準(zhǔn)確地打斷致病序列，產(chǎn)生治療效果。他們報(bào)告稱，Cas9酶可以有效區(qū)分EGFR突變型等位基因與野生型等位基因，從而破壞致癌基因，誘發(fā)癌細(xì)胞死亡。

Dow提醒，雖然CRISPR具有顯著的靶特異性，但其切割結(jié)果高度多變。因此，如果目標(biāo)是在所有病例中都產(chǎn)生一致的遺傳變化，那么Cas9之類的核酸酶就不是一個(gè)好選擇了。傳統(tǒng)CRISPR系統(tǒng)中DNA修復(fù)的隨機(jī)性意味著，你需要面對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性的問(wèn)題。

一個(gè)乳腺癌細(xì)胞在顯微鏡下遷移。

GEM有其局限性，特別是在疾病的發(fā)展時(shí)間和異質(zhì)性方面。據(jù)Hughes解釋，小鼠腫瘤發(fā)展非?？?，從而迫使研究人員加快他們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，但這與人類疾病的發(fā)展速度大不相同。此外，小鼠腫瘤往往過(guò)于同質(zhì)，而無(wú)法正確反映人類疾?。篏EM通常只包含一兩個(gè)基因改變，而人類腫瘤通常有很多基因改變。

為了解決缺乏異質(zhì)性的問(wèn)題，并產(chǎn)生更忠實(shí)于人類癌癥的模型，德州大學(xué)安德森癌癥中心（University of Texas MD Anderson Cancer Center）的生物醫(yī)學(xué)科學(xué)家Lorenzo Federico等人在系統(tǒng)生物學(xué)家Gordon Mills的實(shí)驗(yàn)室里展開(kāi)研究，設(shè)計(jì)了一系列來(lái)自轉(zhuǎn)基因小鼠原發(fā)乳腺腫瘤的可移植細(xì)胞系。zui后他們得到了12個(gè)新的小鼠移植細(xì)胞系——可以可靠地產(chǎn)生具有一系列突變的特定類型的腫瘤小鼠模型。Federico表示，理想的情況是，不同小鼠發(fā)生的不同原發(fā)性腫瘤應(yīng)具有不同的分子改變，以更忠實(shí)地反映人類癌癥的遺傳特征。

這些模型已被用于靶向治療（包括癌癥分子途徑抑制劑）的臨床前評(píng)估。根據(jù)Federico的說(shuō)法，這些模型也非常適合研究免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生和治療發(fā)展中的作用。然而，他指出，由于這些移植物來(lái)源于基因工程小鼠腫瘤，對(duì)于得到的結(jié)果，“我們需要保持謹(jǐn)慎”。

癌癥如何發(fā)生和發(fā)展，取決于它與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用。其中一些zui有希望的治療方法是免疫療法，它通過(guò)激活患者的免疫系統(tǒng)來(lái)攻擊特定的腫瘤。為了研究這些療法，科學(xué)家需要具有完整免疫系統(tǒng)的小鼠——是具有人類的免疫系統(tǒng)。這就需要人源化的小鼠模型。

為了讓GEM擁有人的免疫系統(tǒng)，科學(xué)家要將人造血干細(xì)胞（多種血細(xì)胞的前體細(xì)胞）植入免疫缺陷的小鼠體內(nèi)。這一過(guò)程重現(xiàn)了人體免疫系統(tǒng)的某些方面，例如負(fù)責(zé)攻擊外來(lái)細(xì)胞的白血球。然后，研究人員便可以將人類腫瘤樣本（病人源性腫瘤異種移植物，patient-derived xenograft, PDX）移植到小鼠體內(nèi)，創(chuàng)建更真實(shí)的人類疾病模型。

根據(jù)Augustin的說(shuō)法，PDX模型越來(lái)越受到藥物的歡迎。藥物開(kāi)發(fā)商將PDX用作藥物測(cè)試的試驗(yàn)基地。PDX模型也開(kāi)始進(jìn)入基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室，并且可以在市場(chǎng)上購(gòu)買到。緬因州巴爾港的杰克遜實(shí)驗(yàn)室（Jackson Laboratory）與超過(guò)20家癌癥診所合作，創(chuàng)建了450多種這類小鼠模型，其中包括急性骨髓性白血病和膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌。Jackson實(shí)驗(yàn)室表示，這些小鼠的成本通常是標(biāo)準(zhǔn)免疫缺陷小鼠的三倍。

科學(xué)家也可以開(kāi)發(fā)自己的PDX小鼠模型。圣裘德兒童研究醫(yī)院（St. Jude Children’s Research Hospital）的腫瘤學(xué)家Elizabeth Stewart等人使用手術(shù)切除的、能反映大腦、骨骼和其它癌癥的小兒實(shí)體瘤樣本，構(gòu)建了67個(gè)PDX小鼠模型，這覆蓋了十多種腫瘤類型。

Stewart等人的目標(biāo)是創(chuàng)建模型來(lái)研究針對(duì)不同腫瘤類型的藥物的治療效果——這需要模型準(zhǔn)確地代表原始疾病。Stewart的研究小組決定使用全基因組和全外顯子DNA測(cè)序技術(shù)，從核酸水平上比較PDX和原始腫瘤。他們發(fā)現(xiàn)，總體而言，PDX的DNA序列在很大程度上與原始腫瘤的基因組特征相匹配，但也出現(xiàn)了新的突變。據(jù)研究人員總結(jié)，PDX“保留了患者腫瘤的分子和細(xì)胞特征，以及其發(fā)育起源的表觀遺傳特征”。

這并不是說(shuō)PDX是靜態(tài)的。哈佛-MIT博德研究所（Broad Institute of Harvard and MIT）的所長(zhǎng)Todd Golub及其研究小組研究了代表24種癌癥的543個(gè)PDX模型中的拷貝數(shù)變異（copy-number variations, CNV）。他們發(fā)現(xiàn)， 原始小鼠1次傳代后，60％的PDX中插入了長(zhǎng)達(dá)500萬(wàn)個(gè)堿基的CNV基因擴(kuò)增區(qū)域，4次傳代后這個(gè)概率是88％。結(jié)果顯示，zui初模仿人類疾病的PDX可以演變成不能模仿人類疾病的形式。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，PDX便不能再模擬目標(biāo)癌癥了。

Boudreau認(rèn)為，將人類PDX模型組織移植到人源化小鼠中會(huì)得到zui有吸引力的一種新癌癥模型，但他表示這“尚未*實(shí)現(xiàn)”，因?yàn)檠芯咳藛T尚未掌握技術(shù)的細(xì)節(jié)。據(jù)她補(bǔ)充，隨著科學(xué)家對(duì)*和腫瘤響應(yīng)的機(jī)制的興趣的增加，人源化小鼠將會(huì)變得非常重要。

回歸原始方法

一些科學(xué)家使用Yamagiwa的老方法，而不是基因技術(shù)來(lái)制造更實(shí)用的癌癥模型。這種化學(xué)致癌方法以普通的實(shí)驗(yàn)室小鼠為研究對(duì)象，結(jié)果可以產(chǎn)生更真實(shí)的癌癥模型。

據(jù)加利福尼亞大學(xué)舊金山分校（University of California, San Francisco）的腫瘤生物學(xué)家Melissa Reeves解釋，用一種致癌物質(zhì)處理小鼠，就像一種環(huán)境因素會(huì)造成特定類型的損傷，并獲得特定類型的腫瘤，如皮膚腫瘤。這對(duì)于模擬由于重復(fù)暴露于特定環(huán)境的人類腫瘤很有幫助，因?yàn)樗M了由廣泛基因損傷引起的腫瘤的自然演變。

化學(xué)致癌物質(zhì)可能會(huì)在數(shù)百個(gè)位點(diǎn)破壞DNA，并且隨著時(shí)間的推移影響會(huì)繼續(xù)存在。Reeves等人采用這種方法，在小鼠皮膚局部涂抹名為DMBA和TPA的已知致癌物，誘導(dǎo)小鼠發(fā)生皮膚癌，進(jìn)而研究腫瘤如何從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移至繼發(fā)部位。她的研究結(jié)果表明，皮膚癌不會(huì)按順序從一個(gè)位置遷移到另一個(gè)位置——例如，從皮膚到淋巴結(jié)再到肺，而是“通過(guò)平行傳播，同時(shí)進(jìn)入淋巴結(jié)和肺部”。

Reeves表示，這一成果證實(shí)了一個(gè)臨床發(fā)現(xiàn)：去除乳腺癌周圍的淋巴結(jié)并不總是能夠提高生存率，這一觀察結(jié)果促使研究人員推測(cè)平行傳播的可能性。

盡管與GEM和人源化小鼠相比，化學(xué)致癌作用可能可以產(chǎn)生更好的、類似于人類癌癥異質(zhì)性的腫瘤，但實(shí)際上這些模型也存在明顯的缺點(diǎn)。通過(guò)化學(xué)手段誘發(fā)原發(fā)性腫瘤，然后將其移除并研究轉(zhuǎn)移過(guò)程，可能需要18個(gè)月。Reeves指出，另外，每個(gè)腫瘤都會(huì)有所不同。

同樣，每種癌癥模型都不盡相同，小鼠模型并不總是的選擇，小鼠的飼養(yǎng)費(fèi)用昂貴，并容易引起倫理問(wèn)題，這讓細(xì)胞系不失為一種值得考慮的研究對(duì)象。

目前，研究人員只能選擇一種zui能解答他們問(wèn)題的模型——盡管存在缺陷。同時(shí)，科學(xué)家將不斷改善現(xiàn)有模型，并開(kāi)發(fā)新模型。正如Augustin指出的那樣，“用于開(kāi)發(fā)和使用臨床轉(zhuǎn)化率更高的小鼠腫瘤模型的投資非常有意義。”否則，我們可能永遠(yuǎn)無(wú)法提高臨床試驗(yàn)中癌癥藥物的成功率。

小鼠并不是研究人員模擬癌癥的*選擇。一種流行的新興替代方法是類器官——模仿一些器官的微觀解剖，例如血管系統(tǒng)的3D細(xì)胞培養(yǎng)物。

法國(guó)奧爾良分子生物物理中心（Centre for Molecular Biophysics）的分子生物學(xué)家Claudine Kieda表示，腫瘤就像是一個(gè)多種組織合作的器官。3D細(xì)胞模型可充分考慮微環(huán)境，例如腫瘤周圍和內(nèi)部的氧氣水平。

Kieda的實(shí)驗(yàn)室將黑素瘤和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合在由膠原蛋白、生長(zhǎng)因子和一個(gè)名為Matrigel的3D支架組成的基質(zhì)中。這種混合物允許細(xì)胞形成類似于腫瘤及其周圍環(huán)境，特別是在氧化方面的結(jié)構(gòu)。Kieda指出，每個(gè)細(xì)胞都在像孵化器那樣的環(huán)境中工作，氧氣的分壓遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體內(nèi)。”

此外，類器官對(duì)于藥物開(kāi)發(fā)也很有價(jià)值。例如，英國(guó)劍橋大學(xué)（University of Cambridge）的組織修復(fù)生物學(xué)家Meritxell Huch等人創(chuàng)建了用于藥物篩選的肝癌類器官。這種類型的腫瘤只有20%的概率能在小鼠身上生長(zhǎng)，但Huch實(shí)現(xiàn)了近80％的成功率——并且該過(guò)程的效率大約是PDX的兩倍。Huch表示，速度是主要優(yōu)勢(shì)。Huch的研究小組利用這些類器官，開(kāi)發(fā)了一種信號(hào)通路抑制劑，以用于治療原發(fā)性肝癌。

與其它癌癥模型一樣，一個(gè)好的類器官要盡可能地忠實(shí)地重現(xiàn)人類疾病。美國(guó)癌癥研究所（US National Cancer Institute）的腫瘤轉(zhuǎn)移研究員Nancy Boudreau表示，類器官比細(xì)胞更具生物學(xué)特性，而且比小鼠便宜。

原文檢索：

Mike May. (2018) Cancer research with a human touch. Nature, 556: 259-261.