醫(yī)學(xué)時(shí)代免疫微環(huán)境分子分型及*耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

*是晚期實(shí)體瘤治療的重要手段之一。經(jīng)過幾十年的長足發(fā)展，歷經(jīng)了腫瘤細(xì)胞因子治療[包含白介素、干擾素、*（即*α1）等]、腫瘤疫苗治療、細(xì)胞*以及免疫檢查點(diǎn)治療幾個(gè)階段。近年來，腫瘤*取得了重大進(jìn)展，《科學(xué)》雜志將腫瘤*列為“2013年科學(xué)突破”*，尤其以PD-1/PD-L1負(fù)性檢查點(diǎn)為代表的單克隆抗體，在晚期實(shí)體瘤治療中取得巨大成功。截至目前為止，已有Pembrolizumab（PD-1單抗）和Nivolumab（PD-1單抗）獲FDA批準(zhǔn)用于治療惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎癌及頭頸部腫瘤，Atezolizumab（PD-L1單抗）、Durvalumab（PD-L1單抗）均獲批用于治療泌尿系上皮腫瘤、非小細(xì)胞肺癌等瘤種。同時(shí)，在范圍內(nèi)，還有數(shù)千個(gè)*相關(guān)的臨床研究正如火如荼地開展。*正改變著惡性腫瘤的治療策略。但不可否認(rèn)的是，單藥PD-1/PD-L1單抗治療的有效率仍然較低。例如，針對非選擇性人群，單藥PD-1單抗在晚期非小細(xì)胞肺癌的客觀有效率為19-22%，在晚期惡性黑色素瘤中為25-35%，在晚期腎癌患者中約為25%，而在晚期頭頸部鱗癌及肝癌中則分別為14%、15%左右。因此，如何進(jìn)一步篩選優(yōu)勢人群，或針對特定人群優(yōu)化免疫聯(lián)合策略，是在醫(yī)學(xué)時(shí)代背景下亟需回答的問題，也是現(xiàn)階段*研究的一大熱點(diǎn)。

目前，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)兩個(gè)*相關(guān)靶標(biāo)用于優(yōu)勢人群篩選：一是PD-L1表達(dá)豐度，利用免疫組化技術(shù)，對微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞及浸潤性免疫細(xì)胞的PD-L1表達(dá)水平進(jìn)行檢測，主要應(yīng)用于晚期非小細(xì)胞肺癌及胃癌的PD-1單抗靶標(biāo)預(yù)測；另一個(gè)是錯配修復(fù)蛋白及微衛(wèi)星不穩(wěn)定（Mismatch repair/microsalite instability，MMR/MSI）的檢測。2017年一項(xiàng)多中心單臂臨床研究數(shù)據(jù)顯示，在149例MSI-H/dMMR的泛瘤種患者中，Pembrolizumab的客觀有效率達(dá)39.6%?；谠摂?shù)據(jù)，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Pembrolizumab用于晚期實(shí)體瘤合并MSI-H/dMMR的患者的二線治療。然而，在臨床實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中，這兩個(gè)靶標(biāo)仍然存在諸多瓶頸。首先，dMMR在多數(shù)晚期實(shí)體瘤中發(fā)生率較低，例如，在晚期結(jié)直腸癌中發(fā)生率為5-8%，晚期胃癌中為3-5%，而晚期肺癌中僅不到2%，這導(dǎo)致了該靶標(biāo)獲益人群的局限；另外，有研究結(jié)果顯示，即使在PD-L1強(qiáng)陽性（超過50%腫瘤細(xì)胞陽性）的晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，PD-1單抗（作為一線治療）的客觀有效率為44.2%；在PD-L1陽性（超過1%腫瘤細(xì)胞陽性）的晚期胃癌三線治療中，有效率僅為22.2%。也就是說，即使經(jīng)過PD-L1的陽性選擇，PD-1單抗仍對一大部分患者無效。因此，想要突破上述瓶頸，進(jìn)一步細(xì)化免疫分型、深入研究耐藥機(jī)制則是當(dāng)下至關(guān)緊要的任務(wù)。

1、細(xì)化微環(huán)境的免疫分型。大量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)證實(shí)，切實(shí)有效的分子分型是指導(dǎo)治療的基礎(chǔ)。腫瘤微環(huán)境涉及要素眾多、關(guān)系復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞得以擺脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)控識別、逃離T細(xì)胞的殺傷，離不開諸多要素的共同作用：如成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞從抑制生長狀態(tài)被腫瘤細(xì)胞馴化為促瘤狀態(tài)（如TAMs分泌大量的蛋白酶、細(xì)胞因子和生長因子促進(jìn)腫瘤生長）；MDSCs和Treg擾亂DCs抗原遞呈，抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖活化和NK細(xì)胞的毒殺作用，干擾腫瘤微環(huán)境的免疫平衡；另外，靜息狀態(tài)下，多數(shù)腫瘤細(xì)胞在蛋白水平不表達(dá)或低表達(dá)PD-L1，僅當(dāng)效應(yīng)性T細(xì)胞浸潤至腫瘤組織、釋放IFN-γ并作用于腫瘤細(xì)胞后，才通過一系列的分子信號途徑誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而介導(dǎo)獲得性免疫耐受的發(fā)生。因此，腫瘤微環(huán)境中，對*產(chǎn)生顯著影響的核心要素是：1.特異性殺傷T細(xì)胞的浸潤豐度；2.依賴于IFN-γ通路的PD-L1表達(dá)情況，以及各種活化性分子的下調(diào)表達(dá)、抑制性分子上調(diào)表達(dá)；3.各種抑制性T細(xì)胞的活化及清除。

陳列平教授團(tuán)隊(duì)2012年即提出，聯(lián)合檢測腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL）及腫瘤微環(huán)境中的PD-L1，能夠優(yōu)化對PD-1單抗的療效預(yù)測?；谶@兩個(gè)指標(biāo)，可以將腫瘤患者初步分為四個(gè)亞型：Type I：獲得性免疫耐受型（TIL+， PD-L1+），這種類型理論上是*，特別是PD-1/PD-L1抑制劑起效的理想分型；Type II：免疫無反應(yīng)型（TIL-， PD-L1-），這種類型是預(yù)后zui差的一種分型，通常需要采用多種策略的聯(lián)合治療來誘發(fā)患者的免疫反應(yīng)；Type III：原發(fā)誘導(dǎo)表達(dá)型（TIL-， PD-L1+），該類型臨床少見，各個(gè)瘤種不一致，PD-L1表達(dá)不依賴于經(jīng)典的IFN-γ途徑，往往通過原癌基因的活化導(dǎo)致PD-L1的固有表達(dá)，前期研究表明這種類型往往對PD-1/PD-L1抑制劑的療效不敏感；Type IV：其他通道逃逸型（TIL+， PD-L1-），針對這一類型目前臨床應(yīng)用討論很不一致，其牽涉到PD-L1的的時(shí)間空間異質(zhì)性，理論上，該腫瘤的免疫逃逸是依賴于其他的抑制性分子產(chǎn)生，需要今后更多的免疫檢查點(diǎn)通路抑制劑的臨床驗(yàn)證。

盡管該分型實(shí)現(xiàn)了免疫細(xì)胞及分子層面的進(jìn)一步細(xì)化，但仍然存在一些問題迫切需要解決：*，PD-L1蛋白表達(dá)的時(shí)間、空間的抑制性以及各個(gè)公司采用的抗體并不一致，導(dǎo)致目前PD-L1檢測存在分歧。例如，Pembrolizumab采用22C3伴隨檢測抗體，Nivolumab采用28-8作為伴隨檢測抗體，Atezolizumab采用SP142作為伴隨檢測抗體，而Durvalumab采用SP263作為伴隨檢測抗體，臨床上各種針對PD-L1檢測的解讀鋪天蓋地，非腫瘤?？漆t(yī)生往往很難甄別，目前在肺癌領(lǐng)域，正在發(fā)起多中心的病理協(xié)作，制定以及比對各個(gè)抗體之間的特異性以及敏感性差異，解決臨床現(xiàn)今檢測的瓶頸；第二，針對TIL細(xì)胞的分類需要進(jìn)一步細(xì)化，而不同類型的TIL浸潤對預(yù)后指導(dǎo)意義大不相同；第三，針對TIL的計(jì)數(shù)評分常采用主觀的二級半定量評分，可重復(fù)性不高，不同中心、不同病理師的閱片判讀結(jié)果不容易達(dá)成一致；第四，常規(guī)方法難以滿足腫瘤微環(huán)境分析的要求，如：蛋白印記和流式細(xì)胞學(xué)的方法丟失了腫瘤的形態(tài)信息；分子水平的檢測（一代、二代測序、qPCR）能夠分辨出足夠多的基因型或細(xì)胞型組分，但無法判斷這些組分在組織原位的空間位置關(guān)系，而這種定位關(guān)系對理解其在微環(huán)境中的作用又是至關(guān)重要的；常規(guī)免疫組化方法無法分辨足夠多的細(xì)胞表型。綜合以上，目前迫切需要開發(fā)出針對腫瘤微環(huán)境的多分子標(biāo)記景觀分析系統(tǒng)，同時(shí)建立每個(gè)分子的標(biāo)準(zhǔn)化檢測流程，滿足目前臨床對免疫微環(huán)境的關(guān)鍵分子標(biāo)記物需要定位、定量、定性分析的需求，同時(shí)還必須滿足可重復(fù)性。例如，目前人工智能在數(shù)字化病理上探索應(yīng)用，以及目前免疫評分體系在腸癌、肺癌以及乳腺癌的初步建立，都是對目前腫瘤免疫微環(huán)境分型的一個(gè)*推動。

2、原發(fā)耐藥的機(jī)制探索。*原發(fā)耐藥包含腫瘤細(xì)胞本身固有因素以及腫瘤細(xì)胞外部因素。固有因素包括：異?；蛲蛔冾l率及總突變負(fù)荷；腫瘤抗原表達(dá)的缺失；原癌基因活化（EGFR、KRAS、MAPK，PI3K、WNT等）導(dǎo)致PD-L1的固有表達(dá)；腫瘤本身缺乏有效的抗原呈遞系統(tǒng)；腫瘤本身缺乏主要組織相容性復(fù)合體（MHC）的表達(dá)；IFN-γ信號途徑的異常突變導(dǎo)致腫瘤對殺傷性T細(xì)胞的不敏感等（見圖1）。而外部因素包括：腫瘤微環(huán)境中缺乏殺傷性T細(xì)胞浸潤； CTLA-4和其他免疫檢查點(diǎn)的異?；罨?；T細(xì)胞衰竭和表型變化；免疫抑制性細(xì)胞群（Treg，MDSC，II型巨噬細(xì)胞）以及腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子和代謝產(chǎn)物釋放（CSF-1，*代謝物 ，TGF-β，腺苷）對免疫微環(huán)境產(chǎn)生的抑制效應(yīng)（見圖2）。

對于上述復(fù)雜過程，如何發(fā)現(xiàn)、干預(yù)并深入挖掘其機(jī)制，是現(xiàn)階段巨大的挑戰(zhàn)。需要基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)以及臨床醫(yī)生的深入合作探索。通常目前認(rèn)為，*各個(gè)環(huán)節(jié)的多策略聯(lián)合治療是逆轉(zhuǎn)耐藥的有效方法，如*、放療與PD-1/PD-L1抑制劑的聯(lián)合使用，特別是局部*逆轉(zhuǎn)耐藥目前已經(jīng)有諸多研究報(bào)道；腫瘤新抗原疫苗不僅可以協(xié)同PD-1/PD-L1增效，同時(shí)有逆轉(zhuǎn)其耐藥的理論基礎(chǔ)；不同免疫檢查點(diǎn)抑制劑的聯(lián)合治療，比如CTLA-4聯(lián)合PD-1/PD-L1抑制劑，目前已有成熟的報(bào)道，而IDO抑制劑、OX40激動劑等正在進(jìn)行臨床研究；抗血管生成聯(lián)合*也有大量的臨床研究正在開展；另外從機(jī)制上看，*可以增強(qiáng)腫瘤抗原提呈作用，同時(shí)還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表面MHC的表達(dá)，從而增強(qiáng)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別，改變腫瘤微環(huán)境，從而在一定程度上逆轉(zhuǎn)耐藥。有臨床前的動物模型研究表明，PD-1抗體聯(lián)合*對荷瘤小鼠肝細(xì)胞癌皮下移植瘤有一定的協(xié)同作用，*可能增強(qiáng)PD-1抗體的腫瘤抑制作用。

此外，對腫瘤、血液及其他樣品采取基線和動態(tài)分析模式，可以幫助我們?yōu)楝F(xiàn)階段及今后的深入研究作好準(zhǔn)備。腫瘤微環(huán)境的基線評估通常包含對血液或組織樣本的總突變負(fù)荷、驅(qū)動基因突變情況以及多基因表達(dá)的綜合分析，也包括對CD8+T細(xì)胞的PD-L1、TCR表達(dá)情況及克隆能力的分析。而在治療前后（治療前、治療早期和進(jìn)展時(shí)間點(diǎn)）對新鮮連續(xù)人類標(biāo)本（腫瘤，血液，血清和微生物組）進(jìn)行縱向動態(tài)評價(jià)，則有可能通過深度分析揭示治療抗性的潛在機(jī)制（見圖3）。這種基線和動態(tài)的分析方法超越了對靜態(tài)時(shí)間點(diǎn)的常規(guī)分析，并能通過動態(tài)評估癌癥應(yīng)答尋找優(yōu)異的預(yù)測性生物標(biāo)志物。因此，它將成為臨床及轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)研究中，深入揭示免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)及耐藥機(jī)制的重要手段。(生物谷）