唾液活檢在腫瘤領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

唾液是澄清透明、呈微酸性的體液，正常人每天可分泌1.0～1.5 L。唾液腺具有高通透性，被豐富的毛細(xì)血管所包繞，這使得血液中的分子與鄰近的唾液腺細(xì)胞中的分子能進(jìn)行自由交換。因此，唾液中不僅含有與血液相同的酶、激素、抗體以及生長(zhǎng)因子等蛋白質(zhì)，還包括mRNA、miRNA和DNA等遺傳信息，且這些物質(zhì)在唾液和血液中的表達(dá)水平密切相關(guān)。血液是傳統(tǒng)的液體活檢材料，基于血液循環(huán)DNA的基因突變檢測(cè)和基于血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分子生物學(xué)分析在腫瘤診斷、臨床治療及預(yù)后評(píng)價(jià)方面具有重要作用。血液中的蛋白質(zhì)及核酸進(jìn)入唾液，使其含有與機(jī)體生理病理狀態(tài)相關(guān)的生物學(xué)信息，因此唾液同樣是有前景的液體活檢材料。

與血液相比，唾液活檢有*的優(yōu)勢(shì)，取材方便、*且可避免血源性的感染。以往認(rèn)為由于解剖位置的特殊性，唾液活檢只對(duì)頭頸部腫瘤(如口腔癌)具有診斷價(jià)值，而越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)它同樣可應(yīng)用于機(jī)體遠(yuǎn)端的腫瘤(如胰腺癌、肺癌、乳腺癌、肝癌)[6]，由此看出唾液活檢不受腫瘤空間位置的限制。而且，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)、核酸的變化均能由唾液活檢進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，不受腫瘤進(jìn)展時(shí)間的限制。本研究以唾液中發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物為線索，從檢測(cè)技術(shù)、臨床應(yīng)用兩個(gè)層面概括唾液活檢在腫瘤領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，并對(duì)其發(fā)展的前景與挑戰(zhàn)進(jìn)行展望。

一、唾液活檢檢測(cè)技術(shù)研究

唾液活檢的主要目的是探尋蛋白質(zhì)含量的變化特征以及核酸分子遺傳信息的改變，以了解機(jī)體在正常與腫瘤狀態(tài)下的差異。近年來隨著質(zhì)譜分析技術(shù)(mass spectrometric analysis，MS)以及二代測(cè)序技術(shù)(next generation qequencing，NGS)的快速發(fā)展，對(duì)唾液蛋白質(zhì)組學(xué)以及基因變異的研究已獲得重大突破。

(一)蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)

唾液蛋白質(zhì)成分具有復(fù)雜性，以往大都用二維聚丙烯凝膠電泳(PAGE)的方法進(jìn)行分離，隨著質(zhì)譜分析儀的發(fā)展，蛋白質(zhì)得以更地分類鑒定，美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校(UCLA)已建立起唾液蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)，包含的蛋白質(zhì)達(dá)千余種，且綜合信息不斷地更新，形成了一個(gè)可在*范圍內(nèi)進(jìn)行交流的平臺(tái)，對(duì)口腔生物學(xué)、唾液診斷學(xué)等領(lǐng)域的研究有巨大推動(dòng)作用[7]。

(二)RNA檢測(cè)技術(shù)

唾液RNA的檢測(cè)方法主要是芯片技術(shù)，其不足之處在于50%的唾液RNA呈片段狀，不攜帶Poly－A尾巴，易被降解；此外在RNA擴(kuò)增試驗(yàn)中多采用隨機(jī)啟動(dòng)的方法，導(dǎo)致了RNA分子信息的丟失。Wong. D T. 團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種用于唾液mRNA擴(kuò)增的試劑盒－Express Art TRinucleotide mRNA Amplification Kit，其特點(diǎn)是用錨定寡核苷酸與三核苷酸引物的混合物替代傳統(tǒng)的寡核苷酸引物，能對(duì)不攜帶Poly－A尾巴的RNA片段進(jìn)行有效的逆轉(zhuǎn)錄；且三核苷酸引物使擴(kuò)增循環(huán)中的逆轉(zhuǎn)錄都遵循統(tǒng)一嚴(yán)格的啟動(dòng)，避免了隨機(jī)擴(kuò)增帶來的RNA信息的丟失。應(yīng)用此方法鑒定的唾液外顯子核心轉(zhuǎn)錄組包括1 370個(gè)探針組合，代表了85%的唾液樣本中851個(gè)特定基因。

(三)基因變異檢測(cè)技術(shù)

1．基因突變檢測(cè)技術(shù)：

目前唾液基因突變檢測(cè)的方法包括普通PCR和微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)相關(guān)的方法。唾液中突變的模板濃度較低，普通PCR容易出現(xiàn)假陰性，ddPCR通過對(duì)樣品的隨機(jī)分布進(jìn)行分析，使生物標(biāo)志物的研究實(shí)現(xiàn)了地"數(shù)字化" 。以表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)突變?yōu)槔?，在T790M突變的非小細(xì)胞肺癌人群中，AZD9291的治療往往受困于獲得性C797S突變引起的繼發(fā)性耐藥。應(yīng)用ddPCR技術(shù)對(duì)C797S進(jìn)行分析，可檢測(cè)到0.05%～0.1%的突變頻率。

此外，值得一提的是處于研發(fā)狀態(tài)的電場(chǎng)誘導(dǎo)釋放定量技術(shù)(Electric Field－Induced Release and Measurement，EFIRM)，該該技術(shù)在檢測(cè)p.E746－A750缺失時(shí)，可檢測(cè)低至0.1%的突變頻率；檢測(cè)L858R時(shí)，1%的突變可被檢測(cè)到，在非小細(xì)胞肺癌組檢測(cè)的唾液和血漿中EGFR突變具有強(qiáng)相關(guān)性(p.E746－A750缺失：R＝0.98, P<0.000 1；L858R點(diǎn)突變：R＝0.99, P<0.000 1)。

2．DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)：

腫瘤組織中的DNA甲基化改變，通過靈敏的方法同樣可在唾液中檢測(cè)到。Illumina公司的Golden Gate DNA甲基化平臺(tái)(DNA Methylation Cancer Panel I)目前廣泛地應(yīng)用于甲基化檢測(cè)，在樣本中的DNA被重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后，探針可以準(zhǔn)確地探測(cè)到甲基化位點(diǎn)[11]。近來興起的全基因組DNA甲基化測(cè)序?qū)⒅貋喠蛩猁}方法和Illumina HiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)相結(jié)合，可達(dá)到單堿基分辨率，快速分析每個(gè)胞嘧啶的甲基化狀態(tài)，從而構(gòu)建精細(xì)的全基因組DNA甲基化圖譜。

二、唾液中潛在的生物標(biāo)志物及臨床應(yīng)用研究

(一)蛋白質(zhì)類標(biāo)志物

人類唾液中含有多種蛋白質(zhì)，雖然含量?jī)H為血液中的30%[6]，但唾液仍然被認(rèn)為是富含蛋白質(zhì)標(biāo)志物的液體活檢材料。

據(jù)報(bào)道，唾液中的白細(xì)胞介素－8、腫瘤壞死因子－α以及轉(zhuǎn)鐵蛋白[12,13,14,15]等可作為檢測(cè)口腔癌的標(biāo)志物，實(shí)驗(yàn)顯示：白細(xì)胞介素－8在區(qū)分口腔鱗狀細(xì)胞癌患者和健康人時(shí)曲線下面積(Area Under The Curve，AUC)值z(mì)ui高，為0.749。近來發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的唾液Cyfra21－1水平[(85.95 ± 78.00)μg/L]高于健康人[(42.27 ± 40.84)μg/L，P＝0.009]；且術(shù)后復(fù)發(fā)患者為[(130.95± 66.38)μg/L]，高于無復(fù)發(fā)人[(74.84 ±63.45)μg/L，P＝0.023。以上表明，唾液中蛋白質(zhì)濃度變化一定程度上反映了口腔癌發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，這對(duì)于口腔癌的篩查、診斷以及復(fù)發(fā)等具有重要參考價(jià)值。

在乳腺癌研究中，Bigler等的結(jié)果顯示唾液中c－erbB－2蛋白濃度在治療后顯著降低(t＝4.245，P<0.000 1)，且隨著治療的進(jìn)行持續(xù)降低。相似地，乳腺癌患者唾液CA15－3水平[(5.26 ± 4.12)U/mg]顯著高于健康組[(2.27± 1.54) U/mg]和乳房良性疾病組[(2.22±1.95) U/mg，P<0.05]。

(二)核酸類標(biāo)志物

1．RNA標(biāo)志物：

在健康人和患者的唾液中能檢測(cè)到3 000余種mRNA和300種miRNA[20,21]，有學(xué)者評(píng)估了唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)標(biāo)志物對(duì)胰腺癌患者的診斷效能，發(fā)現(xiàn)12種mRNA水平在胰腺癌患者和健康人之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合應(yīng)用其中的4種：KRAS、MBD3L2、ACRV1和DPM1，能夠?qū)@兩個(gè)群體進(jìn)行區(qū)分，AUC值為0.971，敏感性和特異性為90%和95%[22]。另有研究發(fā)現(xiàn)，唾液中miR－9、miR－134和miR－191在區(qū)分頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者和健康人時(shí)具有很好的效能，AUC值分別為0.85(P<0.000 1), 0.74(P<0.001) 和0.98(P<0.000 1)。

2．DNA標(biāo)志物：

基因突變是癌癥患者DNA分子中常見的遺傳變異，現(xiàn)已成為癌癥診斷、靶向治療以及療效監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。近年來，隨著游離DNA(cfDNA)在液體活檢領(lǐng)域成為熱點(diǎn)，唾液作為一種新興的檢測(cè)cfDNA突變的材料受到了廣泛關(guān)注。在40例晚期非小細(xì)胞肺癌患者的唾液樣本中，探索19號(hào)外顯子p.E746－A750缺失和21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變的診斷效能，AUC值分別為0.94和0.96[10]，這表明唾液cfDNA的EGFR突變檢測(cè)可作為非小細(xì)胞肺癌的診斷指標(biāo)應(yīng)用于臨床。

在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，DNA甲基化是zui早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一。Viet和Schmidt[11]研究了口腔鱗癌患者唾液DNA的甲基化位點(diǎn)，構(gòu)造了甲基化標(biāo)志物池，其敏感度為62%～77%，特異度達(dá)83%～100%。另外，有研究發(fā)現(xiàn)隨年齡的增長(zhǎng)DNA甲基化模式發(fā)生改變，EDARADD、TOM1L1和NPTX2三個(gè)基因的甲基化與年齡的增長(zhǎng)呈線性相關(guān)[24]，這說明基于唾液的甲基化檢測(cè)篩查對(duì)年齡相關(guān)性疾病可能具有一定可行性。

綜上，新技術(shù)的發(fā)展*地促進(jìn)了唾液活檢的發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)其在腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，我們根據(jù)相關(guān)技術(shù)與臨床應(yīng)用將唾液活檢的研究現(xiàn)狀進(jìn)行匯總整理，見表1。

表1目前唾液中發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物

三、唾液研究的前景和挑戰(zhàn)

過去十年時(shí)間里唾液的優(yōu)點(diǎn)不斷被實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，促進(jìn)了唾液診斷學(xué)無價(jià)值論向前景論轉(zhuǎn)變。目前初步結(jié)果顯示，唾液不但可以用來診斷口腔癌等頭頸部區(qū)域的局部腫瘤，對(duì)于肺癌、胰腺癌和乳腺癌等遠(yuǎn)處腫瘤同樣具有診斷價(jià)值，然而仍需進(jìn)一步的科學(xué)驗(yàn)證為唾液的診斷能力提供支持?；诖罅垦芯空咚龅呐Γ僖涸\斷學(xué)研究呈現(xiàn)出的盛況，在未來醫(yī)學(xué)中唾液檢測(cè)將會(huì)成為體格檢查的項(xiàng)目，以協(xié)助臨床醫(yī)生對(duì)疾病進(jìn)行篩查和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

然而將唾液檢測(cè)應(yīng)用到臨床還要克服眾多限制條件，比如，相比理論我們實(shí)際可獲得的唾液體積有限，以及唾液中尚有大量的標(biāo)志物處于未知階段。未來將唾液腫瘤標(biāo)志物作為檢測(cè)項(xiàng)目，良好的質(zhì)量控制是保障檢測(cè)結(jié)果快速、準(zhǔn)確、及時(shí)的基礎(chǔ)，質(zhì)量控制的核心是對(duì)分析前、分析中和分析后各因素實(shí)施嚴(yán)格的系統(tǒng)性規(guī)范，主要包括分析前標(biāo)本采集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存(溫度要求)等條件的一致性，分析中標(biāo)準(zhǔn)化、分析后參考區(qū)間、醫(yī)學(xué)決定水平和解釋性備注等的標(biāo)準(zhǔn)化，zui終目標(biāo)是使在不同時(shí)間、地點(diǎn)及分析系統(tǒng)上得到的檢測(cè)結(jié)果具有分析質(zhì)量和臨床要求上的等同性。當(dāng)前的首要挑戰(zhàn)是探索唾液中的標(biāo)志物并通過具體實(shí)驗(yàn)確定其特異性和敏感性、實(shí)現(xiàn)收集方法和處理方法的規(guī)范化，進(jìn)而解決質(zhì)控樣本標(biāo)準(zhǔn)化及商品化的問題。一旦攻克了這些難題，并在大型臨床試驗(yàn)中加以驗(yàn)證，唾液診斷學(xué)才能zui終獲得FDA的批準(zhǔn)而廣泛應(yīng)用于臨床。