《Cell》：?jiǎn)渭?xì)胞組蛋白修飾模型展示表觀遺傳多樣性隨著衰老而增加

染色質(zhì)修飾包括組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾，組蛋白多樣性。連同DNA一起調(diào)控表觀遺傳表型。雖然染色質(zhì)修飾在多種生理學(xué)過(guò)程和人類疾病中都有重要的意義，但是由于此前存在的技術(shù)檢測(cè)通道有限，無(wú)法同時(shí)檢測(cè)各種免疫細(xì)胞亞群特異性marker和各種染色質(zhì)修飾。因此在人類免疫細(xì)胞中進(jìn)行染色質(zhì)研究具有挑戰(zhàn)性。近期出現(xiàn)的一個(gè)技術(shù)突破——質(zhì)譜流式技術(shù)，可以在少量細(xì)胞甚至是單細(xì)胞中進(jìn)行四十種以上參數(shù)采集，可以應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)。斯坦福大學(xué)Alex J. Kuo實(shí)驗(yàn)室利用該技術(shù)，設(shè)計(jì)了進(jìn)行表觀遺傳研究的Panel Assay——epiTOF，將其運(yùn)用到免疫細(xì)胞的組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾研究上。其成果近期（2018年5月）在Cell上發(fā)表。在文章中，利用epiTOF對(duì)人的免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分析，描述了不同免疫細(xì)胞亞群中染色質(zhì)修飾種類和水平概觀。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了1根據(jù)染色質(zhì)修飾形態(tài)可將免疫細(xì)胞分出特定亞群。2個(gè)體和細(xì)胞之間的染色質(zhì)修飾多樣性隨著衰老而增加。3與衰老相關(guān)的染色質(zhì)修飾變化主要受到非遺傳因素的影響。 這一研究把質(zhì)譜流式技術(shù)的應(yīng)用擴(kuò)展到表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域。

該研究選取24位健康人PBMC樣本，在22種主要的免疫細(xì)胞亞群中檢測(cè)8種組蛋白修飾類型和4種組蛋白（組蛋白類型和修飾類型請(qǐng)見(jiàn)Fig1），每個(gè)細(xì)胞中采集和分析的參數(shù)達(dá)到70種以上。由于質(zhì)譜流式檢測(cè)到的數(shù)據(jù)是多參數(shù)和單細(xì)胞的，因此可以根據(jù)免疫細(xì)胞的染色質(zhì)修飾情況進(jìn)行表觀遺傳分群。結(jié)果顯示，靜息的免疫細(xì)胞顯示出亞群特異的染色質(zhì)修飾特征；淋巴來(lái)源和骨髓來(lái)源的免疫細(xì)胞具有各自特異的標(biāo)記特征；單細(xì)胞的染色質(zhì)修飾組成的分子標(biāo)記可以預(yù)測(cè)該細(xì)胞的類型。作者把24位健康人分為兩組進(jìn)行研究，每組包括6位25歲以下的年輕人（3男3女）和6位65歲以上的老年人（3男3女），通過(guò)年輕人和老年人的染色質(zhì)修飾情況對(duì)比發(fā)現(xiàn)，隨著衰老，個(gè)體間和細(xì)胞間的染色質(zhì)修飾差異性顯著增加。對(duì)于19對(duì)雙胞胎的染色質(zhì)修飾研究發(fā)現(xiàn)，70%的差異性增加情況是由于環(huán)境因素導(dǎo)致的?？傊@篇文獻(xiàn)開(kāi)發(fā)了一個(gè)高通量多參數(shù)的研究方法，用于人類免疫細(xì)胞中進(jìn)行單細(xì)胞水平的染色質(zhì)修飾研究，研究結(jié)果揭示了衰老影響表觀遺傳的機(jī)制以及自然和營(yíng)養(yǎng)在衰老的人類細(xì)胞中染色質(zhì)動(dòng)態(tài)中的相關(guān)貢獻(xiàn)。

Fig1 文章的整體研究思路和發(fā)現(xiàn)。作者利用質(zhì)譜流式技術(shù)，對(duì)人免疫細(xì)胞樣本中的4種組蛋白，8種組蛋白修飾類型進(jìn)行研究分析，結(jié)果顯示修飾具有細(xì)胞類型特異性和譜系特異性。隨著衰老，細(xì)胞間和個(gè)體間的差異性增加，通過(guò)對(duì)雙胞胎群體的研究發(fā)現(xiàn)，這一衰老相關(guān)的表觀遺傳變化主要是受到非遺傳性因素的影響。

作者首先對(duì)免疫細(xì)胞亞群中的各種染色質(zhì)修飾概況進(jìn)行了研究（Fig2，對(duì)應(yīng)原文Fig1C）。染色質(zhì)修飾數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化是采用線性回歸模型，利用整體組蛋白表達(dá)作為預(yù)測(cè)變量。數(shù)據(jù)分析集中在修飾水平和差異性。整體變化如Fig2所示。修飾具有亞群特異性，比如，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出相似的修飾表型，NK細(xì)胞的所有修飾水平相對(duì)于其他亞群都處于低水平。此外，在CD14+ Monocytes中，cleaved H3 Thr22修飾以及PADI4表達(dá)水平顯著升高。而組蛋白變體H3.3表達(dá)和H3K27me修飾水平下降。逆辛普森多樣性指數(shù)分析（ISDI）顯示cleaved H3 Thr22和H2A.Z修飾具有zui大的樣本間差異性，macroH2A， PADI4，和H2BK120ub顯示出zui小的樣本間差異性等。對(duì)于以上發(fā)現(xiàn)，作者采用傳統(tǒng)流式進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果*一致。聚類算法顯示，骨髓來(lái)源的免疫細(xì)胞相對(duì)于淋巴來(lái)源的免疫細(xì)胞具有以下特征： H3.3和H3K27me3修飾水平降低，cleaved histone H3 Thr22， H3K36me1水平升高， PADI4 表達(dá)。此外作者還發(fā)現(xiàn)H3K27me3的賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶EZH1和 EZH2在淋巴前體細(xì)胞和T細(xì)胞中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于骨髓前體細(xì)胞和Monocytes。這個(gè)發(fā)現(xiàn)支持了H3K27me3修飾水平區(qū)別決定HSC分化方向的假說(shuō)。作者隨后進(jìn)行的ChIP-seq研究結(jié)果同樣驗(yàn)證了這一結(jié)論。

Fig2 免疫細(xì)胞亞群中的各種染色質(zhì)修飾概況。圖中展示了不同免疫細(xì)胞亞群中各種組蛋白修飾的水平和樣本間差異性。

隨后作者對(duì)于質(zhì)譜流式所得到的單細(xì)胞多參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行了PCA分析，結(jié)果顯示，基于染色質(zhì)修飾類型及水平同樣可以將各種免疫細(xì)胞亞群區(qū)分開(kāi)來(lái)，其中， 骨髓來(lái)源的Monocytes和其他亞群的區(qū)分度更高，這同樣支持了骨髓來(lái)源和淋巴來(lái)源的免疫細(xì)胞染色質(zhì)修飾具有其特異性這一結(jié)論（Fig3，對(duì)應(yīng)原文Fig2A）。

Fig3 基于染色質(zhì)修飾類型及水平對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行分群。其中骨髓來(lái)源的Monocyte和其他免疫細(xì)胞亞群展現(xiàn)出更大的差異性。

得到以上結(jié)論后，作者將研究集中在11種T細(xì)胞亞群中，檢測(cè)了40種染色質(zhì)修飾?；谌旧|(zhì)修飾結(jié)果的聚類分析自動(dòng)分出了αβ T細(xì)胞和γδT細(xì)胞亞群，說(shuō)明這兩個(gè)亞群的染色質(zhì)修飾具有特異性。Na？ve CD4+ T，Na？ve CD8+ T以及Effector，Memory T細(xì)胞各自被自動(dòng)聚類在一起，這說(shuō)明T細(xì)胞亞群的染色質(zhì)修飾具有功能特異性。這些結(jié)果顯示，T細(xì)胞亞群的染色質(zhì)修飾具有可塑性，很可能是根據(jù)其在獲得性免疫中的特定免疫功能進(jìn)行重置。與分化初期的Na？ve T細(xì)胞相比，在分化終端的Memory T細(xì)胞中， H3S10ph（在正在轉(zhuǎn)錄基因的啟動(dòng)子處會(huì)被檢測(cè)到）修飾水平顯著上調(diào)。與此同時(shí)，常染色質(zhì)相關(guān)的H3K27me1和H3K36me1兩種修飾水平也出現(xiàn)上調(diào)，異染色質(zhì)相關(guān)的組蛋白修飾H3K27me3， H4K20me3，和H3K9me2修飾水平出現(xiàn)下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明Memory T細(xì)胞中的染色質(zhì)處于更加易于轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)。與所有CD4+T細(xì)胞相比，在Treg中，H3K27me1 和 H3K27ac修飾顯著上調(diào)，H3K27me3修飾水平顯著下調(diào)。預(yù)示了在Treg中進(jìn)行以上修飾生物學(xué)研究的重要性。除了T細(xì)胞以后，作者對(duì)于CD56bright和CD56dim的NK細(xì)胞染色質(zhì)修飾也進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)CD56bright NK細(xì)胞和CD56dim的NK細(xì)胞或者其他淋巴來(lái)源的免疫亞群無(wú)法聚類在一起，這預(yù)示了CD56bright NK細(xì)胞與CD56dim的NK細(xì)胞很可能來(lái)源于不同的干祖細(xì)胞（Data not shown，請(qǐng)參考原文Fig3D and Fig3E）。

Fig4 T細(xì)胞亞群中，染色質(zhì)修飾概況。T細(xì)胞亞群的染色質(zhì)修飾具有功能特異性。

完成在不同細(xì)胞亞群中的染色質(zhì)修飾研究以后，作者把研究轉(zhuǎn)向在衰老過(guò)程中染色質(zhì)修飾的變化情況。對(duì)比了12個(gè)25歲以下的年輕人和12個(gè)65歲以上的老年人的染色質(zhì)修飾情況（涉及40種染色質(zhì)修飾和20種免疫細(xì)胞亞群，共計(jì)800種數(shù)據(jù)點(diǎn)），結(jié)果顯示隨著衰老，大多數(shù)免疫細(xì)胞中的多數(shù)修飾水平均有增加，但是CD45RO+CD197+ central memory CD8+ T細(xì)胞中的共檢測(cè)了40種修飾，其中34種水平降低。這暗示著central memory CD8+ T細(xì)胞中的染色質(zhì)衰老機(jī)制很可能是*的。除此之外，作者對(duì)于年輕人和老年人的樣本進(jìn)行了多重t-TEST分析，對(duì)比前述800種數(shù)據(jù)點(diǎn)的CV值，結(jié)果顯示其中61.8%的數(shù)據(jù)點(diǎn)在老年樣本中呈現(xiàn)了更高的細(xì)胞間差異性。這些差異性增加的修飾包括H3K27me3， H3K27me2 H2AK119ub， 這些修飾都是由polycomb抑制性復(fù)合物1或者2 (PRC1 或 PRC2)催化（Fig5）。此前有報(bào)道顯示PRCs在轉(zhuǎn)錄沉默和染色質(zhì)致密化過(guò)程中有重要作用(Margueron and Reinberg， 2011). H3K4me3在多種免疫細(xì)胞亞群中隨著年齡的增加沒(méi)有發(fā)生顯著變化，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，隨著衰老，H3K27me3 標(biāo)記的基因的轉(zhuǎn)錄水平變化相對(duì)于H3K4me3標(biāo)記的基因轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出更大的差異性。這一發(fā)現(xiàn)預(yù)示了下述模型：隨著衰老而提高的表觀遺傳噪音，尤其是PRC介導(dǎo)的H3K27me3，導(dǎo)致了單細(xì)胞之間染色質(zhì)狀態(tài)的差異，并zui終引發(fā)了衰老進(jìn)程中轉(zhuǎn)錄噪音的增加。

Fig5在衰老過(guò)程中染色質(zhì)修飾的變化情況

作者提出的問(wèn)題是衰老過(guò)程中的差異性增加是否由遺傳性因素決定。選取了9對(duì)同卵雙胞胎和10對(duì)異卵雙胞胎進(jìn)行研究。利用經(jīng)典的ACE模型分析數(shù)據(jù)得出結(jié)論如下：70%的組蛋白差異性取決于非遺傳性因素（其中包括13.5%的共享環(huán)境因素和56.5%的*環(huán)境因素），30%差異性取決于遺傳性因素。其中CD45RO-CCR7+ naive， CD45RO+CCD7+ central memory和CD45RO+CCD7- effector memory CD4+ T 細(xì)胞在CD4+ T細(xì)胞中的占比由遺傳因素決定。

REFERENCE

PeggieCheung， et al.， Single-Cell Chromatin Modification Profiling Reveals Increased Epigenetic Variations with Aging. Cell， 2018.