Nature：利用CRISPR讓一個(gè)靶基因在一天之內(nèi)經(jīng)歷整個(gè)進(jìn)化過(guò)程

生命是極其多樣化的。通過(guò)服用抗生素來(lái)阻止感染或使用酵母釀造啤酒，我們正在使用通過(guò)自然進(jìn)化產(chǎn)生的有用產(chǎn)品和過(guò)程。但是，當(dāng)我們想要的性狀在自然界中無(wú)法找到時(shí)會(huì)發(fā)生什么？

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校創(chuàng)新基因組學(xué)研究所的研究人員開發(fā)出一種利用進(jìn)化力量的變革型新方法。相關(guān)研究結(jié)果于2018年8月1日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“CRISPR-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window”。論文通信作者為加州大學(xué)伯克利分校創(chuàng)新基因組學(xué)研究所的David Schaffer和John Dueber，論文作者為在Schaffer實(shí)驗(yàn)室和Dueber實(shí)驗(yàn)室從事科研的博士生Shakked Halperin。這些研究人員描述了CRISPR的另一個(gè)創(chuàng)造性應(yīng)用：一種促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)特定基因進(jìn)化的平臺(tái)。他們創(chuàng)造性的新系統(tǒng)“EvolvR”讓科學(xué)家們能夠在他們選擇的基因中重組DNA堿基，直到找到恰到好處的變異。這種技術(shù)開辟了無(wú)數(shù)的可能性，如通過(guò)改造構(gòu)建出地將廢物轉(zhuǎn)化為生物燃料的酵母，或開發(fā)新的人類療法。

圖片來(lái)自Shakked Halperin。

并不是毫無(wú)意義

想象一只猴子坐在鍵盤上。如果給予無(wú)限的時(shí)間隨機(jī)地按鍵，這只猴子幾乎肯定會(huì)輸入威廉•莎士比亞的全部作品。至少，這是根據(jù)“無(wú)限猴子定理（infinite monkey theorem）”得出的結(jié)論。DNA的自然變異類似于這一過(guò)程---隨著時(shí)間的推移，不同有機(jī)體的基因組中都會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)變化。理論上，在無(wú)限長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，DNA堿基的每一種可能的變異都將存在。然而，在實(shí)際的人類時(shí)間線上，僅很小一部分可能的變化將會(huì)出現(xiàn)。

如今想象一下，我們能夠告訴這只猴子僅重寫莎士比亞悲劇《麥克白》的特定頁(yè)面。在這個(gè)這個(gè)狹小的頁(yè)面窗口的限制下，這只猴子會(huì)非?？斓剌敵鲞@些頁(yè)面中的文本的每個(gè)可能的變化。這就是EvolvR讓科學(xué)家們所做的事情。他們僅想要獲得單個(gè)基因的新版本，因此重寫整個(gè)基因組是不切實(shí)際的，并且可能對(duì)活細(xì)胞是有害的。通過(guò)每次僅對(duì)一個(gè)基因進(jìn)行干擾，就有可能對(duì)大量的變異進(jìn)行取樣。

輕擊“進(jìn)化（evolve）”開關(guān)

EvolvR讓科學(xué)家們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中僅在一天內(nèi)讓一個(gè)基因經(jīng)歷整個(gè)進(jìn)化過(guò)程。該系統(tǒng)基于可編程的DNA切割蛋白Cas9，這就使得EvolvR成為CRISPR工具箱中的一種性工具。這些研究人員將Cas9結(jié)合到一種被稱作DNA聚合酶的酶上。Cas9經(jīng)編程后在有機(jī)體的DNA中找到特定的靶序列。EvolvR使用Cas9的一種特殊“切口（nicking）”版本，僅切割兩條DNA鏈中的一條。Cas9在一條DNA鏈上產(chǎn)生一個(gè)切口，這就指示DNA聚合酶移除這條鏈并用新的DNA替換它。DNA聚合酶會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤，構(gòu)建出與原始DNA序列不同的DNA序列，就像鍵盤上的猴子按鍵一樣。

鑒于多樣性就是人們想要的目標(biāo)，DNA聚合酶產(chǎn)生的“打字錯(cuò)誤”是一件好事?？茖W(xué)家們能夠利用EvolvR故意地產(chǎn)生隨機(jī)突變，從而構(gòu)建出數(shù)百萬(wàn)種不同的序列組合，并且可能至少發(fā)現(xiàn)一種具有他們想要的效果的序列組合。

定向進(jìn)化技術(shù)不斷發(fā)展

這種方法是實(shí)現(xiàn)生物系統(tǒng)多樣化的一種全新方式，打開了與早期策略相結(jié)合的大門。其他方法依賴于迫使大量的隨機(jī)化DNA片段“文庫(kù)”進(jìn)入細(xì)胞。這是耗時(shí)且昂貴的，并且并非所有細(xì)胞都容易攝入外部DNA。EvolvR解決了以前方法中的這些缺點(diǎn)和其他的幾個(gè)缺點(diǎn)。 Dueber指出，“它不像許多其他技術(shù)那樣需要雙鏈DNA斷裂。雙鏈斷裂對(duì)許多細(xì)胞都是有害的。它也不需要復(fù)雜的DNA修復(fù)通路，這是因?yàn)樵S多讓人們感興趣的有機(jī)體都沒(méi)有這些復(fù)雜的DNA修復(fù)通路。”

因此，這種工具應(yīng)當(dāng)可以在任何物種中使用，而且測(cè)試這個(gè)想法是這些研究人員馬上就要實(shí)施的后續(xù)步驟之一。雖然它的試驗(yàn)場(chǎng)是在細(xì)菌中，但在人類或植物細(xì)胞等真核生物中使用時(shí)，這種多功能平臺(tái)將會(huì)變得更加強(qiáng)大。Schaffer說(shuō)，“EvolvR有巨大的潛力作為一種獨(dú)立于物種的定向進(jìn)化工具。它已經(jīng)可以在長(zhǎng)大約十幾個(gè)到幾百個(gè)堿基對(duì)的DNA區(qū)域中進(jìn)行單個(gè)突變或組合突變。”Dueber補(bǔ)充道，“我們有興趣構(gòu)建出一個(gè)適用的EvolvR工具包。我們?cè)O(shè)想的系統(tǒng)具有更高的突變率或更大影響的窗口。有很多想法可供嘗試。”

Halperin指出了這種系統(tǒng)的另一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。早期在實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生性狀的方法包括幾輪勞動(dòng)密集型的多樣化和選擇操作。“在以前的定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)中，我們沒(méi)有借鑒大自然所做的事情。鑒于我們的工具能夠不斷為靶基因提供多樣性，我們能夠不斷地富集越來(lái)遠(yuǎn)好的性狀，這更接近于自然進(jìn)化過(guò)程。”只要研究人員想要開展多長(zhǎng)時(shí)間，那么基于EvolvR開展的實(shí)驗(yàn)就可以持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間，這會(huì)一遍又一遍地改變靶基因的序列并創(chuàng)造更多的成功機(jī)會(huì)。 

出發(fā)

有太多的可能性去想象，而且這些研究人員希望其他科學(xué)家們能夠使用EvolvR。Halperin說(shuō)，“我們很高興其他人與我們一起使用這個(gè)工具并改進(jìn)它。”Schaffer渴望運(yùn)用這種工具，以“加速用于人類治療應(yīng)用（從新藥到新藥遞送技術(shù)）的生物分子開發(fā)。”

讓這些研究人員特別興奮的是將EvolvR與另一種受歡迎的CRISPR工具---高通量CRISPR篩選---相結(jié)合。這種強(qiáng)大的技術(shù)組合可以讓他們?cè)谝淮螌?shí)驗(yàn)中給數(shù)千個(gè)不同的基因提供多樣化，這潛在地創(chuàng)造出全新的功能，而不僅僅是開啟和關(guān)閉基因。（生物谷）

參考資料：

Shakked O. Halperin, Connor J. Tou, Eric B. Wong et al. CRISPR-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window. Nature, Published Online: 01 August 2018, doi:10.1038/s41586-018-0384-8.