蛋白質(zhì)純化親和層析法

若表達(dá)蛋白質(zhì)上含有一段六個(gè)His 的片段，而親和吸附膠上接有鎳離子，此蛋白質(zhì)會(huì)特異性地結(jié)合到吸著膠體；洗去雜質(zhì)后可imidazole 洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)。（Pharmacia 操作手冊(cè)， Affinity Chromatography）。

儀器設(shè)備：

親和層析管柱 （Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm）

部分收集器 （另需準(zhǔn)備干凈試管約25 支）

藥品試劑：

金屬螯合親和層析膠體 （Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210） 1 mL

◆ 在交聯(lián)瓊脂糖凝膠上接有nitrilotriacetic acid （NTA） 官能基，可以螯合鎳離子；使用前先以鎳離子飽和的。

Buffer B-300/0 （50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl）

◆ 使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol.

Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole

Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole

方法步驟：

1） 親和層析膠體1 mL 已經(jīng)裝填在管柱內(nèi)，成為一淡藍(lán)色膠柱。請(qǐng)把管柱架直在鐵架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，準(zhǔn)備注入樣本。

2） 除去膠面上方的緩沖液，并取出樣本 （IEX） 使其回到室溫，慢慢用滴管加到親和膠體上，小心勿弄亂膠體表面；讓樣本沒(méi)入膠體中，同時(shí)收集流出液每管2.5 mL.

3） 待樣本全部進(jìn)入膠體后，關(guān)閉出口，再慢慢加入buffer B-300/20,打開(kāi)出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL.

4） 接著以buffer B-300/250 流洗30 mL,方法同上，收集。

5） 所有收集均定量蛋白質(zhì)并測(cè)定酶活性，取收集酶活性zui高的數(shù)個(gè)，共得 _______ mL （AF），保留100 μL 以供分析。