質(zhì)譜鑒定常見(jiàn)問(wèn)題解答

1. 一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜有什么區(qū)別？什么時(shí)候做一級(jí)，什么時(shí)候做二級(jí)？

答：一級(jí)質(zhì)譜鑒定的方式主要指胎指紋圖譜（PMF），即利用質(zhì)譜儀測(cè)量酶解片段的分子量并搜庫(kù)比較實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定，二級(jí)質(zhì)譜是在一級(jí)質(zhì)譜的基礎(chǔ)上再選擇部分肽段做進(jìn)一步的破碎并對(duì)碎片進(jìn)行深入分析和比較，鑒定出該肽段的序列并結(jié)合PMF的結(jié)果從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定。二級(jí)質(zhì)譜能夠得到部分肽短的序列，具有更高的可靠性。隨著現(xiàn)在雜志對(duì)數(shù)據(jù)的要求越來(lái)越嚴(yán)格，二級(jí)質(zhì)譜鑒定是蛋白鑒定的大趨勢(shì)，而且即使目前做一級(jí)質(zhì)譜鑒定的結(jié)果，也需要挑選部分PMF結(jié)果做二級(jí)質(zhì)譜驗(yàn)證。

2. 研究的物種不是模式生物怎么辦？

答：可以參考親緣關(guān)系近的模式生物做比對(duì)而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的成功鑒定，如果質(zhì)譜圖很好而沒(méi)有鑒定結(jié)果說(shuō)明這是一個(gè)全新的蛋白，可以采用de-novo等技術(shù)做深入分析與鑒定。

3. 該如何評(píng)價(jià)質(zhì)譜效果的好壞？

答：做PMF一般得分超過(guò)60分（P<0.05）就算成功鑒定，而串聯(lián)質(zhì)譜，得分超過(guò)60分或者雖然沒(méi)有超過(guò)60分，但是有少一條肽段的得分超過(guò)30分就算成功鑒定。

4. 一些特殊的質(zhì)譜方法有什么用途？

答：質(zhì)譜的其它用途包括磷酸化位點(diǎn)分析、蛋白測(cè)序、混合蛋白鑒定（shotgun技術(shù)）以及分子量測(cè)定、二硫鍵位置分析等等。

5. 用什么染色方法比較好？

答：hao用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色，銀染也可以，但鑒定成功率稍低，并且*用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)銀染蛋白進(jìn)行鑒定可以大大提高鑒定成功率。

6. 凝膠是否可以*保存？該如何保持？對(duì)鑒定效果有影響嗎？

答：如果保存時(shí)間超過(guò)一個(gè)月，可以用保鮮膜包裹后放入冰箱保持，如果小于一個(gè)月，則可以常溫保持，不會(huì)影響質(zhì)譜鑒定效果。

7. 質(zhì)譜鑒定取膠點(diǎn)該如何取？有什么注意事項(xiàng)？

答：取點(diǎn)的時(shí)候?qū)?.2ml的槍頭前端剪去一點(diǎn)，用槍頭將凝膠戳取下來(lái)并轉(zhuǎn)移至0.5ml離心管中，用水將膠粒反復(fù)吸打沖洗兩至三次，后吸干離心管中所有水分封蓋保存。水用去離子水或者雙蒸水；取點(diǎn)的時(shí)候帶好口罩與手套，以免角蛋白污染。