貼壁、懸浮、原代細(xì)胞感染Protocol及常見(jiàn)問(wèn)題解答

慢病毒是當(dāng)前zui熱門的基因操作工具，其感染譜廣，可有效地感染腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而為基因功能的研究提供了更強(qiáng)有力的工具。然而仍有一部分細(xì)胞，尤其是原代細(xì)胞和懸浮細(xì)胞由于細(xì)胞特性，很難獲得的感染效率。為了提高細(xì)胞的感染效率，我們常常選擇多加病毒或使用Polybrene等助感染試劑，然而細(xì)胞狀態(tài)卻變差了，且增加感染效率并沒(méi)有達(dá)到理解的效果，這是什么原因呢？
 
一、對(duì)慢病毒感染出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行原因分析

1. 細(xì)胞狀態(tài)變差——細(xì)胞毒性 
 

• 雜質(zhì)：病毒溶液中殘留的雜質(zhì)蛋白、內(nèi)毒素及宿主細(xì)胞DNA等是造成細(xì)胞毒性的主要因素。特別對(duì)于某些外源刺激敏感的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這是病毒感染細(xì)胞后，狀態(tài)差異的主要原因。
• 過(guò)度感染：外源基因過(guò)度表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致目的細(xì)胞本身正常新陳代謝失衡。這是有些細(xì)胞過(guò)感會(huì)死亡的主要原因。

2. 病毒加了不少，效果不理想，如何增加感染效率——了解影響慢病毒感染效率的因素
 

• 細(xì)胞膜的流動(dòng)性
• 細(xì)胞膜表面受體的表達(dá)豐度
• 病毒與細(xì)胞的接觸面積和接觸幾率
• 細(xì)胞膜與病毒外殼蛋白電荷的多少

 
二、如何有針對(duì)性地增加慢病毒感染效率

了解了影響細(xì)胞狀態(tài)和感染效率的原因后，我們就可以有針對(duì)性的進(jìn)行調(diào)整。
 
1.  使用高滴度高純度的慢病毒，可以減少病毒中的雜質(zhì)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響：降低慢病毒對(duì)細(xì)胞的毒性
2.  調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，感染時(shí)使用對(duì)數(shù)期的細(xì)胞：增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性
3.  降低感染時(shí)血清濃度，使用無(wú)血清/低血清的培養(yǎng)基：降低血清蛋白對(duì)病毒外殼蛋白的封閉
4.  離心法，感染時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)板密封，用平角轉(zhuǎn)子離心機(jī)1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)：增加慢病毒與細(xì)胞的接觸幾率，但對(duì)細(xì)胞有一定的機(jī)械損傷，儀器要求高
5.  感染時(shí)加入Rentronectin等纖粘蛋白：增加慢病毒與細(xì)胞接觸幾率，但會(huì)影響細(xì)胞的貼壁狀態(tài)
6.  使用傳統(tǒng)的助感染試劑，如Polybrene：中和細(xì)胞膜和病毒粒子之間的電荷排斥，但Polybrene本身就具有細(xì)胞毒性，部分細(xì)胞對(duì)Polybrene敏感，容易導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差、形態(tài)發(fā)生變化、甚至死亡。

三、特殊細(xì)胞慢病毒感染注意事項(xiàng)

1. 懸浮細(xì)胞
    對(duì)于懸浮細(xì)胞，可采用離心感染方法提高感染效率。如將細(xì)胞培養(yǎng)板密封后，用平角轉(zhuǎn)子離心機(jī)1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。
 
2. 極難感染的細(xì)胞
    對(duì)于極難感染的細(xì)胞，可采用多次感染的方法，即感染一次后，重新加入新鮮病毒再次感染，可顯著提升感染效率。但需要注意調(diào)整兩次感染間細(xì)胞狀態(tài)。
 
3. 傳代能力較差的原代細(xì)胞、非分裂細(xì)胞
    原代細(xì)胞：由于細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢，可以在接種時(shí)提高匯合度到50%～60%，確保在感染后4天時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～100%；
    非分裂細(xì)胞：如神經(jīng)元細(xì)胞，接種后不再增殖，需要按照100%的匯合度進(jìn)行接種。 


 


Q：慢病毒如何稀釋？
A：用常規(guī)培養(yǎng)基、生理鹽水、Hanks液、PBS液等將慢病毒稀釋到需要的滴度。如原病毒標(biāo)記滴度為5 x 10⁸ TU/ml，則取20 µl病毒液加入到80 µl的常規(guī)培養(yǎng)基中，即可得到1 x 10⁸ TU/ml的病毒稀釋液。
 

Q：如何確定向細(xì)胞中加入慢病毒的*時(shí)間？
A：慢病毒感染細(xì)胞后需要4天的時(shí)間才能觀察到慢病毒攜帶的基因表達(dá)，應(yīng)在細(xì)胞匯合度20~40%時(shí)且細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)加入慢病毒，確保在感染后4天時(shí)細(xì)胞增長(zhǎng)達(dá)到90%～100%的匯合度。
 
Q：加入慢病毒病毒后，細(xì)胞死亡很厲害，該如何處理？
A：這種情況是由于慢病毒對(duì)該細(xì)胞有一定的毒性作用，需要調(diào)整并降低感染的MOI值，并且在感染后4小時(shí)、8 小時(shí)、12 小時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)，則需要立刻對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液操作，使用新鮮的*培養(yǎng)液替換病毒感染培養(yǎng)液。
 
Q：如何提高慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率？
A：慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率受多個(gè)因素影響，如細(xì)胞自身生長(zhǎng)的狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞被慢病毒感染的難易程度等。因此保證細(xì)胞正常增殖，輪廓清晰，合適的細(xì)胞密度，選擇*的感染條件可以更好的保證感染效率。對(duì)于懸浮細(xì)胞，可采用離心感染方法，減少病毒感染時(shí)的體積，從而提高感染效率。如將細(xì)胞培養(yǎng)板密封后，用平角轉(zhuǎn)子離心機(jī)1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。