顯微鏡使用調(diào)試方法實(shí)操

在了解了顯微鏡各主要部件的名稱、構(gòu)造和功能之后，為了更好地發(fā)揮顯微鏡的各種功能，提高工作效率，保證在顯微觀察及顯微照像過程中取得佳效果，使用人員必須了解和掌握顯微鏡正確的調(diào)試方法和使用方法。尤其在新一代顯微鏡中，具備了多種功能，能進(jìn)行多種顯微鏡檢方法觀察，正確的試調(diào)方法和使用方法就顯得尤為重要。下面以研究顯微鏡為例，簡(jiǎn)述調(diào)試及使用方法。

1. 顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整　

為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明，在顯微鏡初次安裝和調(diào)試時(shí)，就必須把照明光路系統(tǒng)調(diào)整好，這是正確使用顯微鏡，并獲得正確、可*結(jié)果的重要手段和基本的要求。此外，正確掌握照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，是使用顯微鏡過程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟，也是在日常使用過程中不時(shí)地檢驗(yàn)顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整主要有以下4項(xiàng)內(nèi)容： 

(1) 照明光源燈室在顯微外的初步調(diào)整 

① 首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素?zé)襞菅b入插座中，安裝時(shí)避免手指直接接觸燈泡（可用柔軟的布或紙隔?。?，以免燈泡上留有指紋等臟物，影響燈泡的使用壽命。

② 把燈室擺在桌面上，接通電源后，用的螺絲刀調(diào)節(jié)燈的調(diào)焦旋鈕孔（標(biāo)有“←→”），使燈絲投影在1-2m外的墻上，將燈絲成像調(diào)至清晰；然后調(diào)節(jié)燈的高低位置調(diào)節(jié)絲孔（標(biāo)有“──”），使燈絲位置高低適當(dāng)；再調(diào)節(jié)燈的左右位置調(diào)節(jié)螺絲孔（標(biāo)有“──”），使燈絲左右位置合適。 

(2) 光源發(fā)光體（燈絲）在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)和校正　目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調(diào)入物鏡的視域范圍內(nèi)，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的前提條件。需要的基本工具：對(duì)中望遠(yuǎn)鏡購置顯微鏡時(shí)已配備。 

① 拔掉燈庫內(nèi)的毛玻璃套筒，把燈室裝回顯微鏡上；

② 選用10×物鏡，開亮光源程序找樣品并調(diào)焦清晰，再換用40×物鏡把樣品調(diào)焦清 晰（40×物鏡可以看清燈絲的全貌）； 

③ 把聚光鏡的孔徑光闌和視場(chǎng)光闌均開到大； 

④ 拔掉其中一個(gè)目鏡，換上對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，抓住白色部分，另一手伸縮黑色接目鏡，就可在視野中看到燈絲像； 

⑤ 如燈絲位置不合適，調(diào)“──”孔，把燈絲像沿水平方向調(diào)好，調(diào)“──”孔，把絲像沿垂直方向調(diào)好，直至將燈絲像調(diào)至剛好充滿物鏡孔徑的光圓像； 

⑥ 調(diào)整完畢后，將毛玻璃套筒插回原位，拔掉對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡作下一步調(diào)整。以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調(diào)整和光源發(fā)光體在顯微鏡內(nèi)位置的校驗(yàn)，只需在顯微鏡初次安裝調(diào)試及更換燈泡時(shí)進(jìn)行，平時(shí)使用顯微鏡時(shí)不能隨意亂調(diào)亂動(dòng)。萬一調(diào)亂時(shí)，可按上述步驟調(diào)回原狀。 

(3) 庫勒照明（Kohler）系統(tǒng)的正確調(diào)整　顯微鏡的正確調(diào)試，主要工作之一是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，而其中的關(guān)鍵是庫勒照明系統(tǒng)的調(diào)整。對(duì)于每一位使用顯微鏡的人員，特別是作顯微照像的人員來說，應(yīng)該對(duì)庫勒照明系統(tǒng)的原理及其調(diào)整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的功能，拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善。庫勒照明系統(tǒng)的原理簡(jiǎn)單來說就是：光源發(fā)光體上任意一點(diǎn)發(fā)出的光，可以照明顯微鏡的視域范圍，而光源發(fā)光體上每一點(diǎn)所發(fā)出的光匯集起來，在顯微鏡的視域中就實(shí)現(xiàn)了非常充分而又均勻的照明。調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的目的，是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明，防止雜散光對(duì)照像系統(tǒng)造成影響或干擾，以免照像時(shí)在底片形成灰霧。高調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的必要部件：視場(chǎng)光闌、可進(jìn)行合軸調(diào)整的聚光鏡系統(tǒng)。 

① 選用10×物鏡和10×目鏡； 

② 把聚光鏡前端透鏡擺進(jìn)光路中，孔徑光闌調(diào)至適中的位置上（不大不小），再把聚光鏡升到頂?shù)奈恢蒙希酃忡R轉(zhuǎn)盤調(diào)至明視野“J”位置； 

③ 把視場(chǎng)光闌調(diào)至?。?.1）； 

④ 載物臺(tái)上放上已封片的生物樣品，開亮光源，調(diào)焦清晰； 

⑤ 視域中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)局部照明的區(qū)域或亮斑，這是視場(chǎng)光闌的模糊像，在其中可以清晰地看到樣品的細(xì)節(jié)；在它之外是較暗的視域，不一定能把樣品的細(xì)節(jié)看得清楚；

⑥ 把聚光鏡微微地向下調(diào)，使視野中的亮斑逐漸收小，慢慢變成一個(gè)清晰的多邊形象，這便是視場(chǎng)光闌的清晰像； 

⑦ 一般情況下，多邊形象并不在視*需要調(diào)整聚光鏡的一對(duì)調(diào)中螺絲，把視場(chǎng)光闌多邊形的像調(diào)至*位置； 

⑧ 逐漸開大視場(chǎng)光闌，使多邊形象成為視域的內(nèi)接多邊形，進(jìn)一步核對(duì)調(diào)中的狀況，如對(duì)中不夠理想，繼續(xù)微微調(diào)對(duì)中螺絲； 

⑨ 將視場(chǎng)光闌稍為再微微開大一些，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上，至此，庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整完畢。 庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好以后，整個(gè)視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用過程中應(yīng)特別注意： a. 視場(chǎng)光闌不可任意開大，但可隨物鏡倍數(shù)的增大而將視場(chǎng)光闌收小，隨物鏡倍數(shù)的減小而開大； b. 聚光鏡的高低位置不準(zhǔn)亂調(diào)，否則會(huì)破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)； c. 使用10×以下物鏡時(shí)要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外，使用10×或10×以上物鏡時(shí)要將前端透鏡擺入光路中； d. 關(guān)于物鏡倍數(shù)與視場(chǎng)光闌大小配合問題，在實(shí)際使用過程中，作為一般觀察不一定要收小或開大視場(chǎng)光闌，但作顯微照相時(shí)，為了避免雜散光線對(duì)照相系統(tǒng)的干擾，以便能拍攝到較完善的照片，則應(yīng)在使用每一個(gè)倍數(shù)的物鏡時(shí)，把視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)到正好消失于所觀察的視域邊上，這是比較繁復(fù)的工作，但又非做不可。較為簡(jiǎn)便的方法是把與各個(gè)倍數(shù)物鏡相對(duì)應(yīng)的視場(chǎng)光闌事先調(diào)整好，并作好記號(hào)，以后使用時(shí)根據(jù)記號(hào)直接調(diào)至相應(yīng)的位置。 

(4) 孔徑光闌的正確使用　由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率，使用時(shí)應(yīng)掌握正確的使用方法。過去由于對(duì)孔徑光闌的認(rèn)識(shí)不足，往往把它當(dāng)作是調(diào)節(jié)視野亮度的工具。雖然調(diào)節(jié)孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度，但會(huì)直接影響成像的反差、對(duì)比度及分辨率，在使用過程中應(yīng)盡可能避免。為了發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用，以便在觀察時(shí)，尤其在作顯微照相時(shí)獲得佳分辨率，在每換用一個(gè)倍數(shù)的物鏡時(shí)，在樣品調(diào)焦清晰后，需要調(diào)節(jié)孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑（物鏡孔徑像）的2/3 。 調(diào)整方法是用對(duì)中望遠(yuǎn)鏡對(duì)焦于視野中黑色相差環(huán)上，調(diào)節(jié)孔徑光闌，可以看到一個(gè)多邊形的孔徑光闌像，然后調(diào)到等于物鏡孔徑像的2/3，即介于黑色相差環(huán)外與圓形視域內(nèi)之間。為方便起見，可把與各倍數(shù)物鏡相對(duì)應(yīng)的孔徑光闌預(yù)先調(diào)整好，并作好標(biāo)記，以免每次使用都要重新調(diào)整。 

2. 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術(shù)概要　顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不同顯微鏡檢術(shù)的需要而進(jìn)行的。所謂顯微鏡檢術(shù)（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時(shí)所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法。以下簡(jiǎn)述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對(duì)應(yīng)的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法。 

(1) 透射光明視野（brightfield）　這是自顯微鏡發(fā)明以來傳統(tǒng)、普遍的應(yīng)用方法?；静考?a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察； b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，配有孔徑光闌。調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后，即可應(yīng)用明視野法。 適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。 注意事項(xiàng)： a. 使用明視野方法觀察時(shí)，一定要將庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好； b. 視場(chǎng)光闌不可任意開大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時(shí)，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實(shí)出和擺進(jìn)光路中； c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野的亮度，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則，會(huì)降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)； d. 作顯微照相時(shí)，每換用一個(gè)倍數(shù)的物鏡，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。 

(2) 透射光相差法（phase-contrast）　這是現(xiàn)代顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強(qiáng)法?；静考合嗖钗镧R、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對(duì)中望遠(yuǎn)鏡、綠色濾光片。 調(diào)整方法： a. 在庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎(chǔ)上，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰； b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到Ph1對(duì)準(zhǔn)轉(zhuǎn)盤刻度線位置，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品； c. 拔掉其中一個(gè)目鏡，換上對(duì)中望遠(yuǎn)鏡，并調(diào)焦于視野中的兩個(gè)相差環(huán)上（物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)）； d. 視野中的兩個(gè)相差環(huán)不一定重合，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個(gè)調(diào)節(jié)裝置（調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕），使透光環(huán)作前后左右移動(dòng)而與黑環(huán)重合； e. 調(diào)整好后，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像； f. 有20×和40×物鏡觀察時(shí)，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph2位置上，用100物鏡時(shí)，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph3位置上。 適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種細(xì)胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。