我國(guó)科研人員開發(fā)出清醒動(dòng)物超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù)

　　2024年11月22日，《Nature Methods》期刊在線發(fā)表了題為《Super-resolution imaging of fast morphological dynamics of neurons in behaving animals》的研究論文。該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學(xué)研究所)王凱研究組完成。研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新型超分辨顯微成像技術(shù)，有效解決了背景噪聲干擾和運(yùn)動(dòng)偽影兩大技術(shù)難題，可在清醒動(dòng)物腦中對(duì)神經(jīng)元的快速動(dòng)態(tài)進(jìn)行超分辨率光學(xué)成像和解析，為研究動(dòng)物學(xué)習(xí)過(guò)程中的神經(jīng)元突觸可塑性基礎(chǔ)提供了有力的新工具。
 

　　理解微觀生命過(guò)程如何有機(jī)構(gòu)成宏觀生命體，并實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的生理功能，是生命科學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。然而，受限于研究技術(shù)手段，微觀動(dòng)態(tài)的研究通常需要在簡(jiǎn)化的離體實(shí)驗(yàn)中開展，使其難以與宏觀生命現(xiàn)象如動(dòng)物的睡眠和學(xué)習(xí)行為等直接建立聯(lián)系。在神經(jīng)科學(xué)研究中，解析突觸的形態(tài)和功能可塑性是探究學(xué)習(xí)記憶底層機(jī)理，進(jìn)而理解大腦工作原理的重要基礎(chǔ)。神經(jīng)元突觸是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。在學(xué)習(xí)記憶等過(guò)程中，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接權(quán)重的改變和突觸形態(tài)的變化高度相關(guān)。使用活體動(dòng)物雙光子顯微成像技術(shù)捕捉突觸在學(xué)習(xí)記憶、睡眠和疾病等過(guò)程中的形成和消亡，極大提升了對(duì)神經(jīng)元形態(tài)可塑性和腦功能之間聯(lián)系的認(rèn)識(shí)。然而，受限于光學(xué)衍射效應(yīng)，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡，包括雙光子顯微鏡，無(wú)法突破200~300納米的分辨率極限，難以進(jìn)一步觀察研究更精細(xì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)。近年來(lái)，新發(fā)展的超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù)可突破光學(xué)衍射極限，并已經(jīng)為突觸研究帶來(lái)了一場(chǎng)技術(shù)革命。然而，由于面臨多項(xiàng)技術(shù)難點(diǎn)，目前超分辨率熒光顯微鏡多應(yīng)用于離體的細(xì)胞和腦片研究，尚未有技術(shù)能夠在清醒動(dòng)物中超分辨解析正常生理和行為狀態(tài)下突觸的結(jié)構(gòu)和功能。因此，開發(fā)能夠應(yīng)用于清醒動(dòng)物的超分辨光學(xué)成像新技術(shù)一直是神經(jīng)科學(xué)和光學(xué)成像技術(shù)領(lǐng)域的長(zhǎng)期愿景和技術(shù)前沿。
 

　　發(fā)展可應(yīng)用于清醒動(dòng)物的超分辨成像技術(shù)面臨兩個(gè)主要的技術(shù)難題，背景噪聲干擾和運(yùn)動(dòng)偽影。單分子定位(PALM\STORM)和結(jié)構(gòu)光照明(SIM)超分辨成像技術(shù)基于寬場(chǎng)成像，受背景噪聲干擾嚴(yán)重。同時(shí)，這些技術(shù)需要樣品在保持靜止的狀態(tài)下采集多張圖片來(lái)重構(gòu)一張超分辨圖片，難以容忍動(dòng)物呼吸和心跳造成的微小移動(dòng)。受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)基于點(diǎn)掃描成像，可通過(guò)共聚焦機(jī)制濾除背景噪聲干擾，但其需要較長(zhǎng)的信號(hào)積累時(shí)間，受運(yùn)動(dòng)偽影干擾嚴(yán)重，只嘗試在麻醉動(dòng)物中開展小視場(chǎng)成像。為了同時(shí)解決這些技術(shù)難題，研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新提出了多模式復(fù)用結(jié)構(gòu)光線照明超分辨顯微成像技術(shù)(MLS-SIM)。該技術(shù)的關(guān)鍵創(chuàng)新在于提出了在單次線掃描成像過(guò)程中，通過(guò)快速切換不同的線照明模式來(lái)分別獲得三個(gè)方向上的超分辨信息，并提出新的超分辨重構(gòu)理論框架，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確高效的超分辨圖像重構(gòu)。在線性熒光激發(fā)模式下，MLS-SIM可以150納米橫向分辨率對(duì)清醒小鼠皮層中神經(jīng)元樹突棘尖刺和軸突終扣微觀動(dòng)態(tài)開展長(zhǎng)達(dá)上千幀的連續(xù)成像，速度達(dá)每秒數(shù)幀，可容忍每秒50微米的樣品運(yùn)動(dòng)而不影響其超分辨成像性能。進(jìn)一步，利用皮秒脈沖激光實(shí)現(xiàn)非線性熒光激發(fā)，非線性MLS-SIM可以將橫向分辨率提高至約100納米，且保持同樣的樣品運(yùn)動(dòng)容忍度。
 

　　多模式復(fù)用結(jié)構(gòu)光線照明超分辨顯微成像技術(shù)填補(bǔ)了超分辨顯微鏡在清醒動(dòng)物上開展成像的空白，并彌補(bǔ)了以往技術(shù)在活體動(dòng)物成像時(shí)長(zhǎng)和光漂白特性上的不足，為在體微觀研究提供了廣闊的前景。利用該技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)在清醒的小鼠大腦中驗(yàn)證了神經(jīng)元樹突棘和軸突終扣上存在著快速變化的尖刺動(dòng)態(tài)，并量化研究了清醒-睡眠循環(huán)中神經(jīng)元的微觀快速動(dòng)態(tài)的改變。該技術(shù)還實(shí)現(xiàn)了雙色超分辨同時(shí)成像，探究了PSD-95蛋白聚團(tuán)的微觀結(jié)構(gòu)與樹突棘發(fā)生之間的聯(lián)系。在雙色成像實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了樹突主干上存在許多動(dòng)態(tài)的小突起，這種突起結(jié)構(gòu)的尺寸大多小于傳統(tǒng)雙光子成像技術(shù)的解析能力，只能通過(guò)超分辨成像進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。動(dòng)態(tài)觀察顯示，樹突主干上的PSD-95聚團(tuán)附近存在著頻繁的小突起生成現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)一段時(shí)間內(nèi)的動(dòng)態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)樹突主干上的PSD-95聚團(tuán)和主干上的小突起存在著顯著的共定位現(xiàn)象。這一新發(fā)現(xiàn)的小突起結(jié)構(gòu)及其與PSD-95的共定位可能暗含樹突棘發(fā)生的細(xì)胞機(jī)制，為未來(lái)的突觸可塑性研究提供了新的證據(jù)。
 

　　總結(jié)而言，該研究開發(fā)了一種新型超分辨成像技術(shù)，同時(shí)解決了背景噪聲干擾和運(yùn)動(dòng)偽影兩大技術(shù)難題，填補(bǔ)了在清醒動(dòng)物中開展超分辨成像的技術(shù)空白。該技術(shù)的出現(xiàn)使得在清醒動(dòng)物生理狀態(tài)下對(duì)神經(jīng)元及其他細(xì)胞的亞細(xì)胞微觀動(dòng)態(tài)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間、大范圍的成像和分析成為可能。這一關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)步為超分辨成像在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了新的有力工具。
 

　　中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學(xué)研究所)的博士畢業(yè)生張宇杰為該研究的第一作者，白璐，王鑫，趙鈺琛，張?zhí)锢俸腿~立晨參與了課題的研究，腦智卓越中心張哲研究員、杜旭飛博士和杜久林研究員參與指導(dǎo)了該項(xiàng)工作，王凱研究員為本論文的通訊作者。這項(xiàng)研究得到了科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金委、上海市及中國(guó)博士后科學(xué)基金的經(jīng)費(fèi)資助。
 

　　多模式復(fù)用結(jié)構(gòu)光線照明超分辨顯微成像技術(shù)MLS-SIM應(yīng)用于清醒小鼠皮層超分辨成像

 

　　圖注(a)MLS-SIM照明范式示意圖。(b)清醒小鼠腦皮層神經(jīng)元形態(tài)的超分辨成像結(jié)果。LC：線共聚焦成像；LCDeconv：經(jīng)過(guò)反卷積處理的線共聚焦成像；MLS-SIM：超分辨成像。標(biāo)尺，5微米。(c)小鼠腦皮層不同深度成像的結(jié)果。標(biāo)尺，2微米。(d)超分辨觀察到樹突棘尖刺的快速和長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)態(tài)。標(biāo)尺，1微米。(e)雙色成像樹突棘形態(tài)和PSD-95蛋白。紫色：膜標(biāo)記mRuby；綠色：EGFP標(biāo)記的PSD-95。標(biāo)尺，500納米。