中國科學院神經(jīng)科學研究所王凱組開發(fā)新型三維神經(jīng)網(wǎng)絡高速電壓成像技術

　　2024年10月8日，《Nature Methods》期刊在線發(fā)表了題為《Volumetric Voltage Imaging of Neuronal Populations in Mouse Brain by Confocal Light Field Microscope》的研究論文。該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學研究所)王凱研究組完成。研究團隊開發(fā)了一種新型三維光場顯微成像技術，顯著提升了神經(jīng)元電壓光學成像的通量。這項技術能夠對小鼠腦三維神經(jīng)網(wǎng)絡中數(shù)百神經(jīng)元的膜電位進行高速同步記錄，為深入解析神經(jīng)網(wǎng)絡的信息處理機制提供了新的有力工具。
 

　　對大腦工作原理的解析離不開對神經(jīng)元進行功能活動的記錄。神經(jīng)元通過細胞膜電位的變化來編碼和傳遞信息，傳統(tǒng)電生理技術主要通過在大腦中插入不同形態(tài)和功能的電極來檢測神經(jīng)元微弱的電信號，這些技術的發(fā)展在歷史上極大推動了神經(jīng)科學的進步。近年來，結合功能熒光探針和光學成像的神經(jīng)元功能光學成像技術在神經(jīng)科學研究中引發(fā)了一場技術革命。與傳統(tǒng)電生理技術相比，光學功能成像技術具有通量高、非侵入和分子特異性高等優(yōu)點。然而，由于直接對神經(jīng)元膜電位進行功能光學成像面臨諸多技術挑戰(zhàn)，目前研究人員普遍選擇通過光學檢測神經(jīng)元的胞內鈣離子濃度來間接獲得神經(jīng)元的激活狀態(tài)。然而，這項技術缺乏解析單個動作電位的時間分辨率，也無法準確記錄神經(jīng)元閾下膜電位的變化，在深入解析神經(jīng)信號處理機制等方面存在不足。因此，開發(fā)能夠對神經(jīng)元膜電位進行大規(guī)模光學記錄的新技術一直是神經(jīng)科學研究的長期愿景和技術前沿。
 

　　相比于鈣離子成像，電壓成像的速度提升近100倍。不僅要求圖像采集速率提高100倍，還對在有限的熒光信號中高效捕捉微弱的電壓信號提出了極高的要求，給電壓敏感熒光探針和光學成像技術帶來了巨大的挑戰(zhàn)。目前，最高通量的電壓光學記錄主要通過寬場熒光顯微鏡對小鼠腦淺表神經(jīng)元進行成像來實現(xiàn)，但其穿透深度小、效率低、通量有限等缺點限制了其在神經(jīng)科學研究中的廣泛應用。
 

　　為了提高電壓成像的通量，并實現(xiàn)對三維神經(jīng)網(wǎng)絡的同步成像，研究團隊開發(fā)了基于三維光場成像技術的電壓成像新方法。三維光場顯微鏡是一種高度并行化的成像技術，能夠在一次相機曝光中對三維體進行同時成像。王凱研究組長期致力于光場成像新技術的開發(fā)，并將其應用于神經(jīng)科學研究：研究團隊曾發(fā)明拓展視場光場顯微鏡，首次實現(xiàn)自由行為斑馬魚的全腦神經(jīng)元鈣離子功能成像(Cong et al., eLife 2017)；并進一步創(chuàng)新提出廣義共聚焦原理，發(fā)明共聚焦光場顯微成像技術，實現(xiàn)小鼠腦神經(jīng)元和三維血管網(wǎng)絡循環(huán)血細胞的快速成像(Zhang et al., Nature Biotechnology 2021)。雖然光場成像的高速成像能力對電壓成像具有天然優(yōu)勢，但仍面臨光效率低，速度與視場的矛盾，以及連續(xù)成像能力不足等問題。為此，研究團隊逐一攻克這些技術難題，首次實現(xiàn)大范圍神經(jīng)元群體的三維電壓成像。
 

　　首先，光場成像需要一個高靈敏度、大靶面的相機來同時記錄多個視角的投影圖像。然而，由于相機的數(shù)據(jù)帶寬受限，大靶面相機的幀率無法滿足電壓成像的速度需求。為此，研究團隊提出通過降低采集圖像的動態(tài)范圍來換取更高的幀率。通常，電壓成像需要較高的動態(tài)范圍來捕捉高基線上微弱變化的信號。但研究團隊采用廣義共聚焦原理(Zhang et al., Nature Biotechnology 2021)，高選擇性濾除背景來降低信號基線，并有效整合多個視角的信息，實現(xiàn)了利用低動態(tài)范圍的相機來高效捕捉微弱的電壓信號。
 

　　進一步地，由于電壓成像信號微弱，極易淹沒在噪聲中。為了最大限度降低系統(tǒng)的噪聲，研究團隊系統(tǒng)性地研究了光場成像中的噪聲來源，發(fā)現(xiàn)激光光源的強度噪聲，掃描振鏡的同步噪聲以及動物血液流動導致的激光散斑噪聲都顯著降低了電壓成像的信噪比。為了克服這些難題，研究人員創(chuàng)新地提出基于單振鏡雙面掃描的共聚焦光場成像技術，結合高數(shù)值孔徑的光照明策略和新數(shù)據(jù)處理方法，有效將系統(tǒng)噪聲降低至泊松噪聲理論極限。
 

　　最后，為了最大化熒光信號的捕獲效率，實現(xiàn)長時程持續(xù)電壓成像，研究團隊優(yōu)化了系統(tǒng)的光學效率。通過自主設計定制密集排列的微透鏡陣列，并最小化光學元件的數(shù)量，系統(tǒng)的通光效率比前期工作提高約3倍。
 

　　研究團隊將這些關鍵創(chuàng)新有機整合在新型共聚焦光場顯微鏡中，實現(xiàn)了對清醒小鼠腦三維視場中(直徑800微米，厚度180微米)數(shù)百個神經(jīng)元的電壓信號開展同步記錄，并以每秒400幀的速度連續(xù)成像超過20分鐘。至此，新型共聚焦光場顯微鏡彌補了電壓成像在成像通量、信噪比與成像時長上的不足，極大地提升了電壓成像的應用范圍。為了驗證電壓成像獲取的信號真實可靠，研究團隊記錄了清醒小鼠初級視皮層中數(shù)百個神經(jīng)元對光柵視覺刺激的反應特性。通過對神經(jīng)元動作電位發(fā)放情況的統(tǒng)計，電壓成像成功鑒別出具有不同方向選擇性的神經(jīng)元，且這些具有調諧特征的神經(jīng)元占比與該區(qū)域已知的神經(jīng)元特性相符。進一步，研究團隊對數(shù)百個神經(jīng)元構成的三維神經(jīng)網(wǎng)絡進行了功能連接分析。由于電壓成像能夠提供神經(jīng)元的閾下膜電位信息，這一分析在傳統(tǒng)鈣離子成像和胞外電生理記錄實驗中無法實現(xiàn)。與膜片鉗記錄相比，電壓成像可在清醒動物中開展，且通量提高約100倍。分析表明，神經(jīng)元之間同時存在興奮性和抑制性功能連接，并且在短距離內，抑制性連接強于興奮性連接。這種興奮-抑制的連接差異在三維空間上近似垂直于皮層表面的圓柱體。
 

　　總結而言，該研究開發(fā)了一種新型三維電壓成像新技術，大幅度提高了電壓成像的通量，使在清醒動物中進行三維神經(jīng)網(wǎng)絡的功能聯(lián)接分析成為可能。這一關鍵技術進步為電壓成像技術的廣泛應用奠定了基礎，為神經(jīng)科學研究提供了新的有力工具。
 

　　中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學研究所)的博士后白璐和副研究員叢林為該研究的共同第一作者，穆宇研究員，徐寧龍研究員和熊志奇研究員參與指導了該項工作，王凱研究員為本論文的通訊作者。這項研究得到了科技部、國家自然科學基金委、中國科學院青促會、上海市及中國博士后科學基金的經(jīng)費資助。
 

圖1 三維光場電壓成像顯微鏡示意圖和小鼠腦三維神經(jīng)網(wǎng)絡電壓成像示例圖