紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)應(yīng)用方法

定量測(cè)定的應(yīng)用方法

多波長(zhǎng)紫外分光光度法

多波長(zhǎng)分光光度法解決了單波長(zhǎng)分光光度法中濁度背景干擾和共存物質(zhì)的光譜干擾問(wèn)

題。多波長(zhǎng)分光光度法適用于混濁樣品，高濃度樣品以及多組分混合物的定量分析。

一、雙波長(zhǎng)紫外分光光度法

雙波長(zhǎng)分光光度法的特點(diǎn)是以樣品濃度本身做參比，用兩束單色光 λ₁ 和 λ₂ 交替入射到

同一樣品溶液中，測(cè)得的是差吸光度⊿A＝⊿λ₁－⊿λ₂，⊿A 與樣品溶液濃度或含量成正比，

而：

⊿A＝Aλ₂－Aλ₁＝（ελ₂－ελ₁）CL （2－14）

因此該法可用于定量分析，雙波長(zhǎng)紫外分光光度法適用于樣品溶液?jiǎn)谓M分測(cè)定和多組分測(cè)

定。多組分測(cè)定主要采用等吸收點(diǎn)法和系數(shù)倍率法。

單組分測(cè)定一般選擇待測(cè)組分的 λ_ma_x 為測(cè)定波長(zhǎng) λ₂，等吸收點(diǎn)波長(zhǎng)或待組分吸收曲線

下端的某一波長(zhǎng)作為參比波長(zhǎng) λ₁，然后測(cè)定差吸光度值（⊿A＝Aλ₂－Aλ₁），求樣品溶液中

待測(cè)組分的含量或濃度。

如果樣品溶液中有共存干擾吸收物質(zhì)，則通常采用等吸收點(diǎn)法和系數(shù)倍率法等。下面

簡(jiǎn)單介紹這兩種方法。

1、等吸收點(diǎn)法

等吸收點(diǎn)波長(zhǎng)的確定可采用作圖法、一波長(zhǎng)固定另一波長(zhǎng)掃描法、精密確定法和快速

簡(jiǎn)便法等。這些內(nèi)容已有許多專(zhuān)著供參考。用等吸收波長(zhǎng)法消除干擾吸收時(shí)，必須滿(mǎn)足，在

干擾組分的吸收光譜中有等吸收點(diǎn)，使差吸光度值⊿A 足夠大。混合樣品溶液兩組分的等吸

收點(diǎn)波長(zhǎng) λ₂ 和 λ₁ 有這樣特點(diǎn)：差吸光度⊿A＝Aλ₂－Aλ₁，只與其中一組分濃度有關(guān)，而與

另一組分濃度無(wú)關(guān)，這是該法的定量基礎(chǔ)；另外應(yīng)該指出等吸收點(diǎn)波長(zhǎng)既可做參比波長(zhǎng)，也

可做測(cè)定波長(zhǎng)。等吸收點(diǎn)法主要用于二組分體系的測(cè)定。下面舉一些應(yīng)用實(shí)例，以加深等吸

收點(diǎn)法的理解。

（1）有機(jī)化合物的測(cè)定實(shí)例

① 均四甲苯和聚苯乙烯的測(cè)定，均四甲苯和聚苯乙烯混合物等吸收點(diǎn)波長(zhǎng)利用作圖法

求得 λ₁＝280.7nm，λ₂＝261.8nm（見(jiàn)圖 1）。在這兩波長(zhǎng)處，對(duì)均四甲苯來(lái)說(shuō)（不論濃

度大?。?/span>⊿A＝Aλ₂－Aλ₁＝0，換言之，⊿A只與聚苯乙烯濃度有關(guān)，所以在這兩

個(gè)選定波長(zhǎng)處測(cè)定混合樣品的吸光度差值⊿A 就可直接求得聚苯乙烯的含量。

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圖 1：均四甲苯和聚苯乙烯混合樣品的 UV 吸收光譜

圖中 聚苯乙烯（4×10^-3 mol/l）

 均四甲苯（1×10^-3 mol/l）

② 2，4，6 三氯*存在下苯本分含量的測(cè)定 2，4，6 三氯*和*混合樣品等吸

收點(diǎn)波長(zhǎng) λ₁＝268 nm（或 325 nm），λ₂＝270 nm（圖 2 為作圖法選擇等吸收點(diǎn)波長(zhǎng)；圖

3 為掃描法，即*的 λ_ma_x＝270 nm 為固定波長(zhǎng)，對(duì)濃度不同的 2，4，6 三氯*溶

液進(jìn)行掃描求得）。同樣道理，選擇這兩個(gè)波長(zhǎng)并測(cè)定在 λ₂ 和 λ₁ 處的吸光度差值⊿A。

⊿A 只與*濃度有關(guān)，而與 2，4，6 三氯*濃度無(wú)關(guān)，所以由⊿A 值便可測(cè)定苯

酚的含量。在鄰硝基*存在下，對(duì)硝基*的測(cè)定也可用雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定。

圖 2：2,4,6-三氯*和*的 UV 吸收光譜

a.*；b.2,4,6-三氯*（濃度為 30ppm）

〔 λ₁=286（或 325）nm，λ₂=270nm 〕

圖 3：固定* λ₂=270nm，對(duì)不同濃度

不同濃度的 2,4,6-三氯*溶液掃描的差吸

收 UV 光譜

③間－苯二甲酸存在下對(duì)－苯二甲酸的測(cè)定 利用作圖法選擇間－苯二甲酸

（10mg/10ml）和對(duì)－苯二酸甲（0.5mg/100ml）的等吸收點(diǎn)波長(zhǎng)為 λ₂＝262.5nm 和 λ₁

＝277.0nm（見(jiàn)圖 4），在此波長(zhǎng)組合下，間－苯二甲酸的⊿Aλ₂－λ₁＝0，對(duì)－苯二甲酸

的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，測(cè)定結(jié)果令人滿(mǎn)意。

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圖 4：間-苯二甲酸和對(duì)-苯二甲酸的 UV 吸收光譜

1—間-苯二甲酸；2—鄰-苯二甲酸

④ 苯偏三酸酐中苯偏三酸的測(cè)定 用作圖法和精密確定法選擇等吸收波長(zhǎng)為

307.6nm，而苯偏三酸的 λ_ma_x＝290nm（見(jiàn)圖 5）。由圖可知，用雙波長(zhǎng)光度法測(cè)得⊿A

＝Aλ₂－Aλ₁，只與苯偏三酸濃度有關(guān)，⊿A 與苯偏三酸酐濃度無(wú)關(guān)。故可利用雙波長(zhǎng)

紫外光度法測(cè)定苯偏三酸含量。

圖 5：苯偏三酸酐和苯偏三酸的 UV 吸收光譜

1—苯偏三酸酐；2—苯偏三酸

（2）在無(wú)機(jī)分析中的實(shí)例

當(dāng)樣品溶液中有兩組分的性質(zhì)相近時(shí)，例如鈷與锝、鐵與鋁、鉑與鈀等，這些組分所

形成的絡(luò)合物的吸收光譜相互重疊，且能夠找到各自的等吸收點(diǎn)，均可采用雙波長(zhǎng)分光光度

法對(duì)共存組分分別測(cè)定。如用 8－羥基喹啉同時(shí)測(cè)定鐵、鋁就是一例。

 圖 6 為鋁和鐵的絡(luò)合物吸收光譜，顯然測(cè)定波長(zhǎng) λ₁＝385.0nm。圖 7 為一波長(zhǎng)固定

（385.0nm）、一波長(zhǎng)掃描所得的曲線，等吸收點(diǎn)波長(zhǎng)（λ₂^′＝437.0nm，和 λ₂＝499.5nm）可

做參比波長(zhǎng)，顯然⊿A＝Aλ₁－Aλ₂^′或 ⊿A＝Aλ₁－Aλ₂ 都消除了干擾組分的影響。

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圖 6：鋁（A）鐵（B）的絡(luò)和物吸收光譜

（λ₁＝385 nm，λ₂’＝263nm，

λ₂＝498 nm）

圖 7：一波長(zhǎng)固定（385nm）一波長(zhǎng)掃描所得

的曲線

Fe₂O₃ 濃 度 (µg/10ml)A—20.0 ； B—60.0 ；

C—100.0

（3）藥物和維生素測(cè)定實(shí)例

① 復(fù)方頭孢氨芐膠囊中頭孢氨芐的測(cè)定 用作圖法求得頭孢氨芐和甲氧芐氨嘧啶

（TMP）混合物等吸收點(diǎn)波長(zhǎng) λ₁＝305.5 nm，λ₂＝263nm（頭孢氨芐的 λ_ma_x），以 λ₂ 為

測(cè)定波長(zhǎng)，λ₁ 為參比波長(zhǎng)，測(cè)量混合物樣品的⊿A，⊿A 只與頭孢氨芐濃度有關(guān)（見(jiàn)圖

8）。因此，可由一系列頭孢氨芐的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在 λ₂＝263nm 和 λ₁＝305.5nm

處測(cè)定吸光度，并求出⊿A，以⊿A 為縱坐標(biāo)，以頭孢氨芐濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲

線。然后按同樣方法測(cè)定樣品中⊿A，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)頭孢氨芐的濃度或含量^[7^]。

② 雙嘧啶片中甲氧芐氨嘧啶（TMP）的測(cè)定 用作圖法求得 TMP 和*（SD）

的等吸收點(diǎn)波長(zhǎng)，λ₂＝274.8nm（為測(cè)定波長(zhǎng)），λ₁＝308nm（為參比波長(zhǎng)），在這兩波

長(zhǎng)處測(cè)得只與 TMP 濃度有關(guān)，與 SD 濃度無(wú)關(guān)。然后可用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，求得樣品中 TMP

 的含量（圖 9）^[8^]。

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圖 8：頭孢氨芐和 TMP 的 UV 吸收光譜

1－頭孢氨芐；2－TMP；

3－頭孢氨芐+TMP

圖 9：TMP 和 SD 的 UV 吸收光譜

a－TMP(30µg/ml)；b－SD(24µg/ml)；

c－輔料

③ 維生素 A 和 E 的測(cè)定 維生素 A 的測(cè)定波長(zhǎng)選在 305nm，維生素 E 對(duì)應(yīng)等吸收波

長(zhǎng)為 270.8nm（見(jiàn)圖 10）。用雙波長(zhǎng)紫外分光光度法測(cè)定⊿A＝Aλ₃0₅－Aλ₂07.₈，則⊿A 只與

維生素 A 含量有關(guān)（與維生素 E 含量無(wú)關(guān)），故可測(cè)定維生素 A 含量。

圖 10：維生素 A、E 的 UV 吸收光譜

1－維生素 A；2－維生素 E

而維生素 E 的 λ_ma_x＝292nm 做測(cè)定波長(zhǎng)，用精密確定法找出維生素 A 對(duì)應(yīng)等吸收點(diǎn)波

長(zhǎng)為 349.9nm，顯然，⊿A＝Aλ₂9₂－Aλ₃49.₉ 只與維生素 E 含量有關(guān)，可用雙波長(zhǎng)紫外分光光

度法測(cè)定。

雙波長(zhǎng)紫外分光光度法的出現(xiàn)，使藥物分析出現(xiàn)了迅猛發(fā)展，許多藥劑中的混合組分都可用

此法測(cè)定，例如，復(fù)方丁氯喘片中的鹽酸溴已胺（λ_ma_x＝314nm）、鹽酸異丙嗪（λ_ma_x＝300nm）

可用雙波長(zhǎng)紫外光度法測(cè)定。又如，阿斯匹林中水楊酸的含量可用⊿A＝Aλ₂60.8

－Aλ₂8₂ 的差吸收值定量，防腐劑中可在⊿A＝Aλ₂54.₄－Aλ₂99.₅ 和⊿A＝Aλ₂6₉－Aλ₂35.₅ 的差吸

光度分別測(cè)定山梨酸鉀和對(duì)－羥基安息香酸含量。

紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)應(yīng)用方法