光遺傳學(xué)研究進(jìn)展

光遺傳學(xué)（optogenetics）是近幾年正在迅速發(fā)展的一項(xiàng)整合了光學(xué)、軟件控制、基因操作技術(shù)、電生理等多學(xué)科交叉的生物工程技術(shù)。其主要原理是首先采用基因操作技術(shù)將光敏感基因（如ChR2，eBR，NaHR3.0，Arch或OptoXR等）轉(zhuǎn)入到神經(jīng)系統(tǒng)中特定類型的細(xì)胞中進(jìn)行特殊離子通道或GPCR的表達(dá)。光感離子通道在不同波長的光照刺激下會分別對陽離子或者陰離子的通過產(chǎn)生選擇性，從而造成細(xì)胞膜兩邊的膜電位發(fā)生變化，達(dá)到對細(xì)胞選擇性地興奮或者抑制的目的。

光遺傳技術(shù)具有*的高時(shí)空分辨率和細(xì)胞類型特異性兩大特點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)手段控制細(xì)胞或有機(jī)體活動的許多缺點(diǎn)，能對神經(jīng)元進(jìn)行非侵入式的定位刺激操作而*改變了神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究狀況，為神經(jīng)科學(xué)提供了革命性的研究手段。光遺傳技術(shù)在將來還有可能發(fā)展出一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新療法。

光遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用在2010年后得到飛速的發(fā)展，應(yīng)用研究領(lǐng)域涵蓋多個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)動物種系（果蠅、線蟲、小鼠、大鼠、絨猴以及食蟹猴等），并涉及神經(jīng)科學(xué)研究的多個(gè)方面，包括神經(jīng)環(huán)路基礎(chǔ)研究、學(xué)習(xí)記憶研究、成癮性研究、運(yùn)動障礙、睡眠障礙、帕金森癥模型、抑郁癥和焦慮癥動物模型等應(yīng)用。

在進(jìn)行光遺傳學(xué)技術(shù)的運(yùn)用過程中，科學(xué)家們首先要尋找尋合適的光敏蛋白；其次進(jìn)行相應(yīng)的遺傳信息傳遞，即通過轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)基因動物系的建立等方法將光敏蛋白的遺傳信息傳遞給目標(biāo)細(xì)胞；隨后科學(xué)家們利用可控性演示，通過從時(shí)間和空間上控制演示光線的特定性，來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞活動的演示；后對研究結(jié)果進(jìn)行讀取，這一過程研究者可以采用電極通過檢測細(xì)胞膜內(nèi)外電壓來測量光敏蛋白的熒光效果變化，并可用熒光性生物傳感器來檢測不同細(xì)胞的讀出值，進(jìn)而通過行為測試來評估調(diào)整細(xì)胞活動對整個(gè)動物的影響。

基于此，針對光遺傳學(xué)技術(shù)近期取得的進(jìn)展，小編進(jìn)行一番盤點(diǎn)，以饗讀者。

1.Cell：重大進(jìn)展！通過讓視紫紅質(zhì)翻轉(zhuǎn)擴(kuò)大光遺傳學(xué)工具包
doi:10.1016/j.cell.2018.09.026

在一項(xiàng)新的研究中，來自美國霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所等研究機(jī)構(gòu)的研究人員發(fā)現(xiàn)一種對一類稱為視紫紅質(zhì)（rhodopsin）的光敏感蛋白進(jìn)行改造的新方法。通過在細(xì)胞膜中翻轉(zhuǎn)這類蛋白，他們能夠產(chǎn)生具有不同特性的工具。相關(guān)研究結(jié)果于2018年10月18日在線發(fā)表在Cell期刊上，論文標(biāo)題為“Expanding the Optogenetics Toolkit by Topological Inversion of Rhodopsins”。論文通信作者為霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的Joshua Dudman和Alla Karpova。這種技術(shù)能夠讓用于光遺傳學(xué)（optogenetics）技術(shù)---一種用光來操縱神經(jīng)元活動的技術(shù)---中的蛋白數(shù)量增加一倍。這些新開發(fā)的雜合視紫紅質(zhì)蛋白讓這些研究人員能夠開展新的實(shí)驗(yàn)，有助于分析大腦回路并研究治療帕金森病背后的神經(jīng)科學(xué)。

受到進(jìn)化的啟發(fā)，在Jennifer Brown、Reza Behnam、Luke Coddington和Gowan Tervo的*下，這些研究人員開發(fā)出一種對新的視紫紅質(zhì)進(jìn)行改造的補(bǔ)充技術(shù)。除了突變之外，重組---通過基因改組（gene reshuffling）讓具有不同功能的蛋白結(jié)構(gòu)域組合在一起---的存在也使得蛋白多樣性在自然界中出現(xiàn)?？茖W(xué)家們認(rèn)為重組對于一小部分蛋白---通過進(jìn)化，它們在細(xì)胞膜中的定向發(fā)生變化---的出現(xiàn)是至關(guān)重要的。

當(dāng)這些研究人員通過在一種視紫紅質(zhì)的一端添加一種新的蛋白來模擬重組時(shí)，它發(fā)生了翻轉(zhuǎn)。這真地是出于意料之外的。如果每一個(gè)現(xiàn)有的經(jīng)過改造的或新發(fā)現(xiàn)的視紫紅質(zhì)在翻轉(zhuǎn)時(shí)都能獲得新功能，那么這可能導(dǎo)致用于光遺傳學(xué)技術(shù)中的蛋白工具翻倍。他們不僅能夠改變蛋白在細(xì)胞膜中的定向，而且還能夠發(fā)現(xiàn)這些新的經(jīng)過改造的視紫紅質(zhì)具有*而有用的新功能。其中的一種的稱為FLInChR（Full Length Inversion of ChR，ChR的全長翻轉(zhuǎn)）的視紫紅質(zhì)剛開始時(shí)起著激活神經(jīng)元的作用。當(dāng)發(fā)生翻轉(zhuǎn)時(shí)，它變成一種強(qiáng)效且快速的抑制劑，可用于開展新的實(shí)驗(yàn)。

2.Science光遺傳學(xué)重大突破！上轉(zhuǎn)換納米顆粒助力大腦深部刺激！或?qū)㈩嵏采窠?jīng)疾病治療！ 
doi:10.1126/science.aaq1144; doi:10.1126/science.aar7379

日本理化研究所（RIKEN）腦科學(xué)研究所研究組長Thomas McHugh及其同事現(xiàn)在找到了將光非侵入性導(dǎo)入到腦深處的新方法。在他們昨天發(fā)表于《Science》上的文章中，他們使用上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）將激光導(dǎo)入到了頭蓋骨深處。這種納米顆粒可以在傳統(tǒng)光遺傳學(xué)無法達(dá)到的深度吸收近紅外光并將它們轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽?。這種方法被用于激活大腦不同區(qū)域的神經(jīng)元、沉默癲癇及激活記憶細(xì)胞。“納米顆?？梢杂行У匮娱L我們光纖可以到達(dá)的深度，從而可以進(jìn)行光的遠(yuǎn)程遞送，實(shí)現(xiàn)非侵入性治療。”McHugh說道。 

除了激活神經(jīng)元，UCNPs也可以用于抑制癲癇小鼠病情。研究人員給小鼠海馬區(qū)注射了可以發(fā)出綠光的納米顆粒，隨后用近紅外光在頭蓋骨表面進(jìn)行照射。結(jié)果這些小鼠的癲癇神經(jīng)元被有效沉默。在另一個(gè)叫做內(nèi)側(cè)隔核的區(qū)域，納米顆粒發(fā)出的光促進(jìn)了神經(jīng)元theta周期（一種重要的腦電波）的同步。在具有恐懼記憶的小鼠中，研究人員使用可以發(fā)光的UCNPs成功在海馬區(qū)激起了小鼠的恐懼記憶。這些神經(jīng)元激活、抑制和記憶激起效應(yīng)只在注射了納米顆粒的小鼠身上觀察到。

3.Science：助推光學(xué)遺傳學(xué)發(fā)展！解析出紫紅質(zhì)通道蛋白2的三維結(jié)構(gòu)
doi:10.1126/science.aan8862; doi:10.1126/science.aar2299

紫紅質(zhì)通道蛋白2（channelrhodopsin 2, ChR2）是一種廣泛用于光遺傳學(xué)技術(shù)（optogenetics）的膜蛋白。光遺傳學(xué)技術(shù)是一種相對較新的技術(shù)，涉及利用光來操縱活的有機(jī)體中的神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞。類似的方法已被用來部分地逆轉(zhuǎn)聽力/視力喪失和控制肌肉收縮。

為了揭示出ChR2的結(jié)構(gòu)，來自德國、法國、俄羅斯和捷克的研究人員使用了一種被稱作X射線衍射的分析技術(shù)。這種技術(shù)僅用于分析以晶體形式存在的蛋白樣品。他們在一種所謂的允許蛋白在不離開膜的情形下自由地移動的立方體脂質(zhì)中間相（cubic lipid mesophase）中培養(yǎng)ChR2蛋白晶體。他們利用波長大約為1埃的X射線照射他們培養(yǎng)的ChR2蛋白晶體，通過分析X射線在這種蛋白晶體中的衍射情況，成功地解析出ChR2蛋白的結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2017年11月24日的Science期刊上，論文標(biāo)題為“Structural insights into ion conduction by channelrhodopsin 2”。

4.Hippocampus：“光遺傳學(xué)”療法或能夠恢復(fù)部分阿茲海默癥患者的記憶
doi:10.1002/hipo.22756

近，來自哥倫比亞大學(xué)的研究者們在《Hippocampus》雜志上發(fā)表文章稱通過光遺傳學(xué)的手段能夠恢復(fù)患阿茲海默癥小鼠的記憶。這一發(fā)現(xiàn)也許能夠改變我們對于這一疾病的理解。

首先，作者通過給小鼠進(jìn)行光遺傳學(xué)改造，使其在儲存記憶的時(shí)候發(fā)射光色的熒光，而在重新獲取記憶的時(shí)候發(fā)射紅色的熒光。之后，作者給予接受了遺傳改造的野生型小鼠與阿茲海默癥小鼠以檸檬氣味的刺激，之后再施加電刺激，從而使這兩項(xiàng)記憶形成關(guān)聯(lián)。一周之后，作者再次給這些小鼠檸檬氣味的刺激。結(jié)果顯示，野生型小鼠能夠同時(shí)出現(xiàn)黃色與紅色的熒光，而且出現(xiàn)了恐懼的表現(xiàn)，這說明其在形成記憶的同時(shí)也發(fā)生了記憶的重新獲取（recall）。然而，阿茲海默癥小鼠大腦發(fā)光的區(qū)域則明顯不同，說明它們的大腦在記憶重新獲取的過程中發(fā)生了紊亂。之后，研究者們利用一束藍(lán)光刺激小鼠的大腦，從而能夠再次激活小鼠對檸檬氣味以及電刺激的記憶，從而小鼠在再次聞到上述氣味的時(shí)候出現(xiàn)了顫栗的表現(xiàn)。

5.Cell：光遺傳學(xué)讓老鼠化身殺手
doi:10.1016/j.cell.2016.12.027

每只老鼠體內(nèi)都隱藏著一個(gè)殺手。研究人員已經(jīng)找到了大腦中控制獵食行為的區(qū)域，并成功找到一種控制其開關(guān)的方式。來自耶魯大學(xué)的Ivan de Araujo博士及其同事發(fā)現(xiàn)了大腦中兩組控制小鼠獵殺行為的神經(jīng)，一組協(xié)調(diào)追逐獵物，另一組則控制頸部和下頜的肌肉，兩組神經(jīng)都在杏仁核中，杏仁核是人體涉及動作、感情和恐懼的區(qū)域。

通過修飾這些神經(jīng)，他們可以通過激光激活這些神經(jīng)，這個(gè)技術(shù)就叫做光遺傳學(xué)，研究團(tuán)隊(duì)因此能夠在任何時(shí)候控制這些通路的開關(guān)。當(dāng)激光關(guān)掉時(shí)，小鼠就正常行走在在籠子周圍，一旦激光打開，小鼠就會狂亂地攻擊它們路途中的任何事物：活蟋蟀、假昆蟲甚至是樹枝或者瓶蓋。它們會撲到獵物上，用爪子抓住獵物并反復(fù)撕咬。

之后，研究人員嘗試分別抑制每組神經(jīng)的功能，當(dāng)他們抑制負(fù)責(zé)追捕獵物的神經(jīng)時(shí)，老鼠追趕速度更慢，但是依然會撕咬；反過來，如果抑制負(fù)責(zé)撕咬的神經(jīng)，老鼠就會追捕獵物，但是不撕咬。

6.Oncotarget：利用光遺傳學(xué)控制腫瘤發(fā)生
doi:10.18632/oncotarget.8036

在一項(xiàng)新的研究中，來自美國塔夫斯大學(xué)的研究人員基于青蛙模型證實(shí)利用光控制細(xì)胞之間的電信號，阻止腫瘤形成，以及在腫瘤形成后，讓它們正?；?。這項(xiàng)研究是報(bào)道利用光遺傳學(xué)特異性地操縱生物電信號從而阻止癌基因誘導(dǎo)的腫瘤形成，和導(dǎo)致癌基因誘導(dǎo)的腫瘤消退。相關(guān)研究結(jié)果于2016年3月16日在線發(fā)表在Oncotarget期刊上，論文標(biāo)題為“Use of genetically encoded， light-gated ion translocators to control tumorigenesis”。

青蛙是一種好的模式生物用于癌癥基礎(chǔ)科學(xué)研究，這是因?yàn)榍嗤芎筒溉閯游锏哪[瘤擁有很多相同的特征，其中就包括快速的細(xì)胞分裂、組織破壞、血管生長增加、浸潤性和含有異常內(nèi)部正電壓的細(xì)胞。相對于細(xì)胞外面，幾乎所有健康的細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)部維持著更大的負(fù)電壓；打開和關(guān)閉細(xì)胞膜中的離子通道能夠?qū)е码妷鹤兊酶诱裕ㄗ尲?xì)胞去極化）或更加負(fù)性（讓細(xì)胞極化）。在其他方面正常的條件下，利用腫瘤的異常生物電信號特征就能夠檢測它們。 

7.Neuron：刪除記憶？未來或許真可以
doi:10.1016/j.neuron.2014.09.037

近日，刊登在雜志Neuron上的一篇研究論文中，來自加州大學(xué)戴維斯分校神經(jīng)科學(xué)研究中心的研究人員利用光成功地剔除掉了小鼠大腦中的特殊記憶，該研究或?yàn)榻沂敬竽X不同部分如何聯(lián)合工作來恢復(fù)情景記憶的機(jī)制提供了一定的思路。

光遺傳學(xué)（Optogenetics）是一種利用光來研究神經(jīng)細(xì)胞的新型技術(shù)，近年來，該技術(shù)正在被科學(xué)家們快速采用作為標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行大腦功能的研究。文章中研究者Kazumasa Tanaka將該技術(shù)應(yīng)用于進(jìn)行記憶恢復(fù)等的研究中，長達(dá)40年來，科學(xué)家們假設(shè)恢復(fù)情景記憶（即便在特殊場所發(fā)生的特殊事件等）涉及大腦皮層和大腦海馬體之間的協(xié)調(diào)活動，該理論就是要研究在情景記憶恢復(fù)過程中涉及大腦皮層和海馬體的大腦活動重新產(chǎn)生活性的模式，從而使得個(gè)體再次經(jīng)歷那些事件，如果海馬體被損傷，那么病人就會失去數(shù)十年的記憶。

文章中，研究人員利用遺傳修飾化的小鼠進(jìn)行研究，當(dāng)小鼠神經(jīng)細(xì)胞被激活后其可以全部發(fā)綠色熒光并且表達(dá)特殊蛋白質(zhì)來促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞被光關(guān)閉，研究者將小鼠置于籠中對其訓(xùn)練，在籠中小鼠會經(jīng)歷電休克，正常情況下處于新環(huán)境中的小鼠會利用嗅覺來適應(yīng)環(huán)境，但是當(dāng)將其進(jìn)行電休克后置于新環(huán)境中，他們就會處于一種恐懼反應(yīng)中。

8.Nature：光遺傳學(xué)工具新希望，光驅(qū)動鈉離子通道KR2結(jié)構(gòu)被解析
doi:10.1038/nature14322

日本科學(xué)家在期刊《自然》發(fā)表學(xué)術(shù)文章稱，他們解析出了光驅(qū)動鈉離子通道蛋白KR2結(jié)構(gòu)，為未來新一代的光遺傳學(xué)工具創(chuàng)造了可能。

很多生物都可以吸收光的能量或者感知光的信息，靠的是一種視紫紅質(zhì)分子。這種分子是有一個(gè)7個(gè)α螺旋跨膜蛋白（視蛋白）通過共價(jià)鍵連接在一個(gè)*分子上。根據(jù)視蛋白的種類可以分為動物和微生物視蛋白。而微生物的視紫紅質(zhì)功能與動物中不同，主要是作為離子通道，離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，感光分子或者是激酶。這種微生物的視紫紅質(zhì)受到越來越多的關(guān)注。這是因?yàn)椋x子通道和離子泵類型的視紫紅質(zhì)可以用來在很多活體生物的神經(jīng)細(xì)胞活動，已經(jīng)成為了神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域非常強(qiáng)大的光遺傳學(xué)工具。

通常認(rèn)為，席夫堿的帶正電荷的氫離子會定位于所有的光離子泵的離子通道中，并且被認(rèn)為可以阻止陰離子和中性分子通過。KR2結(jié)構(gòu)的解析又提出了新問題，就是這種離子泵是如何轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子的。

9.Neuron：芝加哥科學(xué)家實(shí)現(xiàn)光遺傳學(xué)技術(shù)新突破
doi:10.1016/j.neuron.2015.02.033

隨著近年來科學(xué)家在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域研究的深入，人們開始希望通過體外刺激的方式來控制體內(nèi)細(xì)胞尤其是神經(jīng)元細(xì)胞的狀態(tài)。這一領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，如治療黃斑病變等遺傳病。以此為基礎(chǔ)，光遺傳學(xué)等學(xué)科紛紛被建立起來。不過，目前為止，為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，研究人員不得不對神經(jīng)元進(jìn)行基因改造。這也*阻礙了這一技術(shù)的普及。

近來自芝加哥大學(xué)和伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校的研究人員們在這一領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了突破。研究人員利用遠(yuǎn)紅外光產(chǎn)生的熱量來控制正常神經(jīng)元細(xì)胞正常的生命活動。不同于以往在正常神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)光敏蛋白的做法，來自芝加哥的科學(xué)家們選擇使用金納米顆粒來定位特定的神經(jīng)元。為了解決金納米顆粒專一性的問題，研究人員將一種蝎神經(jīng)毒素Ts1連接到金納米顆粒上。Ts1可以通過識別神經(jīng)元細(xì)胞表面的鈉離子通道來靶向識別神經(jīng)元細(xì)胞。這也是人類在不改造神經(jīng)元遺傳特性的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)光控神經(jīng)元活動的目的。不過，這一研究仍處于早期階段，研究人員同時(shí)表示Ts1可能對神經(jīng)元細(xì)胞存在毒性。這一研究工作被發(fā)表在Neuron雜志上。

10.Nat Methods：光敏劑控制細(xì)胞靶向
doi:10.1038/nmeth.3735

發(fā)表于雜志Nature Methods上的一項(xiàng)研究報(bào)告中，來自美國卡內(nèi)基梅隆大學(xué)的研究人員為光遺傳學(xué)中的光敏劑重新設(shè)計(jì)開發(fā)了一種熒光探針用于控制細(xì)胞，該項(xiàng)技術(shù)或可幫助理解特定細(xì)胞和蛋白質(zhì)在疾病發(fā)生中的作用，也為后期開發(fā)癌癥或其它疾病的靶向性療法提供希望。

光遺傳學(xué)就是利用光來控制機(jī)體的生物學(xué)過程，研究者通常通過將光激活的組分重新編程入有機(jī)體的遺傳代碼中來實(shí)現(xiàn)光控細(xì)胞的過程，當(dāng)這些組分暴露于光下，其就會促進(jìn)部分機(jī)體組織發(fā)揮*不同的功能。研究者花費(fèi)了將近10年時(shí)間來開發(fā)名為熒光團(tuán)激活蛋白（fluorogen-activating proteins，F(xiàn)APs）的熒光探針，其常被用于在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)監(jiān)測蛋白質(zhì)的活性，一種熒光團(tuán)激活蛋白通常會在細(xì)胞中進(jìn)行遺傳性地表達(dá)，當(dāng)其同名為熒光發(fā)生素的熒光染料接觸時(shí)，復(fù)合物就會發(fā)光從而使得科學(xué)家們可以對其進(jìn)行觀察和追蹤。

研究者Bruchez說道，為了開發(fā)光遺傳學(xué)的標(biāo)簽，文章中我們對熒光染料進(jìn)行了工程化操作，使其不僅可以發(fā)光，而且還可以產(chǎn)生單線態(tài)氧(Singlet Oxygen)，單線態(tài)氧是一種氧氣的毒性形式，當(dāng)其結(jié)合熒光團(tuán)激活蛋白并且暴露于光下后，靶向熒光團(tuán)激活蛋白及光敏劑激活方法(FAP-TAPS)就會使得科學(xué)家們清楚看到標(biāo)記的蛋白質(zhì)，同時(shí)還可以選擇性地抑制這些蛋白質(zhì)的活性。（生物谷）